A kromatin doxorubicin által előidézett globális változásai és topológiai heterogenitása

Nánási, Péter

A kromatin doxorubicin által előidézett globális változásai és topológiai heterogenitása

dc.contributor.advisor	Szabó, Gábor
dc.contributor.author	Nánási, Péter
dc.contributor.authorvariant	Nánási, Péter
dc.contributor.department	Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola	hu
dc.contributor.submitterdep	DE--Általános Orvostudományi Kar -- Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet
dc.date.accessioned	2021-05-27T12:36:09Z
dc.date.available	2021-05-27T12:36:09Z
dc.date.created	2021	hu_HU
dc.date.defended	2021-06-10
dc.description.abstract	A Doxorubicin (Dox) egy széles körben használt kemoterápiás szer, melynek mellékhatásai összefüggnek komplex hatásmechanizmusával. Megvizsgáltam a Dox kromatinra gyakorolt hatását és a következő eredményeket értem el: Létrehoztam egy pásztázó lézer mikroszkópos kísérleti rendszert, mellyel kimutattam, hogy a Dox a H2A hiszton sejtmagon belüli aggregációját indukálja, melyet nem kísér a H2B hiszton aggregációja. A Dox az endogén H2B hiszton nukleo-citoplazmatikus transzlokációját okozza koncentráció- és időfüggő módon Jurkat, hPBMC és DC sejtekben. A Dox indukált H2B nukleo-citoplazmatikus transzlokációja a fehérjelebontási folyamatokra ható PYR-41-gyel gátolható, és nem szüntethető meg a CRM1 mediált nukleáris export gátlásával. A SUMO-iláció gátlása részben antagonizálta a PYR-41 gátló hatását a H2B Dox indukálta transzlokációjára. A munkámban leírt, Dox által kiváltott globális kromatinszerkezet változásoknak orvosbiológiai jelentősége lehet az antraciklinek hatásai és mellékhatásai szempontjából egyaránt. Mivel a Dox és egyéb antraciklinek kromatinba történő interkalációja függ a DNS topológiai állapotától, feltérképeztem az endogén DNS egyszál folytonosság-hiányok következtében kialakuló relaxált kromatin régiókat, melyek a DNS interkalátor gyógyszerek DNS kötődésének predilekciós pontjai lehetnek. Beállítottam egy molekuláris combing alapú kísérleti rendszert, mely alkalmas a jelölt egyedi DNS szálak fluoreszcenciás módszerrel történő vizualizálására. DNS immunoprecipitációs, szekvenálásos kísérletben endogén DNS egyszál folytonosság-hiányokat térképeztem hPBMC sejtek DNS-én. Megállapítottam, hogy azok az aktív gének promoterein halmozódnak. Szuperfeloldású mikroszkópiával kolokalizációt detektáltam DNS egyszál folytonosság-hiányok és Ser5/Ser2-foszforilált RNS polimeráz II között. Molekuláris combing kísérletekkel kimutattam, hogy a DNS egyszál folytonosság-hiányok kolokalizálnak TDP2-jelöléssel kimutatott TopII-vel hPBMC sejteken. A kromatinállomány fentiekben jellemzett topológiai kettőssége a magasabbrendű kromatinszerkezet alapvető szervező mechanizmusának tűnik. A relaxált domének az interkalálódó ágensek preferált támadáspontjaiként elsődlegesen járulhatnak hozzá az ilyen drogok sejtmagi hatásainak kiváltásához.	hu_HU
dc.description.abstract	Doxorubicin (Dox) is a widely used DNA intercalator chemotherapeutic agent with pleiotropic effects and side effects. I have investigated the the effects of Dox on chromatin: I set up a scanning laser microscopic experimental system to show that Dox induces intranuclear aggregation of the H2A histone, and that this process is not accompanied by the aggregation of H2B I observed a novel phenomenon: Dox elicits the nucleo-cytoplasmic translocation of H2B in a concentration- and time-dependent manner in Jurkat, hPBMC, and DC cells The Dox-induced nucleo-cytoplasmic translocation of H2B can be inhibited with PYR-41, which affects protein degradation processes. The translocation cannot be abolished by the inhibition of CRM1-mediated nuclear export, while inhibition of SUMO-ylation partially antagonized the inhibitory effect of PYR-41 on Dox-induced H2B translocation. My observations can be interpreted in light of the spontaneous aggregation of histones evicted during intercalation, implicating protein degradation and nucleo-cytoplasmic export pathways in their clearance from the nucleus. The Dox-induced changes in global chromatin structure described in my work may have biomedical significance in connection with both the effects and side effects of anthracyclines. Since intercalation of Dox and other anthracyclines into the DNA is favored by its relaxed topological state, I mapped the endogenous DNA breaks that may be preferred sites for the binding of such drugs. I have set up a molecular combing-based experimental system suitable for the fluorescence visualization of labeled individual DNA strands. I mapped endogenous ssDNA breaks on the DNA of hPBMC cells by DNA immunoprecipitation and sequencing the promoters of active genes. I found that ssDNA breaks accumulate on the promoter regions of actively transcribing genes. With superresolution microscopy, I detected co-localization between the free 3’OH-marked DNA breaks and Ser5 / Ser2-phosphorylated RNA polymerase II. I have shown by molecular combing experiments that the free 3’OH-marked DNA breaks co-localize with TDP2-labeled TopII in hPBMC cells. The general picture emerging from the above shows that the strand breaks studied are of functional significance for gene regulation and also represent a global organizing principle for higher order chromatin structure. The relaxed domains associated with the breaks may be the primary targets of DNA intercalating drugs.	hu_HU
dc.format.extent	118	hu_HU
dc.identifier.uri	http://hdl.handle.net/2437/310396
dc.language.iso	hu	hu_HU
dc.language.iso	en	hu_HU
dc.subject	DNA nick	hu_HU
dc.subject	nucleo-citoplasmic translocation	hu_HU
dc.subject	doxorubicin	hu_HU
dc.subject	kromatin aggregáció	hu_HU
dc.subject	chromatin aggregation	hu_HU
dc.subject	nukleo-citoplazmatikus transzlokáció	hu_HU
dc.subject.discipline	Elméleti orvostudományok	hu
dc.subject.sciencefield	Orvostudományok	hu
dc.title	A kromatin doxorubicin által előidézett globális változásai és topológiai heterogenitása	hu_HU
dc.title.translated	Doxorubicin-induced global changes and topological heterogeneity of chromatin	hu_HU