Humán FXIII-B sushi domének expresszálása rovarsejtekben

Abstract

Bevezetés: A XIII-as faktor egy protranszglutamináz, mely fontos szerepet tölt be a stabil véralvadék kialakulásában. A plazmában FXIII-A és FXIII-B alegységekből álló heterotetramer (FXIII-A2B2) formában kering. A FXIII-A alegység a katalitikusan aktív alegység, trombin és Ca2+ hatására aktiválódik, miközben a védő, szállító B alegység eltávozik. A FXIII-A homodimer formában megtalálható különböző sejtekben is. A FXIII-B alegységet, mely 10 sushi doménből épül fel, a májsejtek szekretálják, a két alegység kapcsolódása nagy valószínűséggel a plazmában történik. Amíg a FXIII-A struktúrája és funkciója intenzíven kutatott terület, viszonylag keveset tudunk a FXIII-B szerkezetéről, funkciójáról és a két alegység kapcsolódásában szerepet játszó struktúrákról. A korábbi irodalmi adatok alapján a két alegység kapcsolódásáért felelős szakasz a FXIII-B alegységben az első két sushi domén valamelyikében található. Célkitűzés: Munkánk során a FXIII-B 1-es sushi doménjéből és a szignál szekvenciából álló rekombináns FXIII-B fragmens (pp-s1), előállítását tűztük ki célul. Anyagok és módszerek: Az expressziót bakulovírus expressziós rendszerrel végeztük pFastBac vektor és sf9 sejtvonal alkalmazásával. Első lépésben a FXIII-B alegység első sushi doménjét az azt megelőző szignál (propeptid) szekvenciával együtt (pp-s1) PCR reakcióval felsokszoroztuk, majd beépítettük a vektorba. Az elkészített rekombináns plazmidot kompetens E. coli baktériumba transzformáltuk. A sikeresen transzformált baktériumokból plazmidokat izoláltunk, majd szekvenálással ellenőríztük, hogy tartalmazzák-e a pp-s1-et. A pp-s1-et tartalmazó plazmiddal sf9 rovarsejtvonalat transzfektáltunk. Eredmények és diszkusszió: A rovarsejtek mikroszkópban vizsgálva muttták a vírusfertőzés tipikus jeleit, azonban a sejtek felülúszójából ill. lizátumából még nem sikerült kimutatni a sushi domén jelenlétét Western blotting technikával. A FXIII-B specifikus poliklonális antitest nem adott reakciót, azonban a használt poliklonális antitest epitóp specificitása nem ismert, ezért csak a pozitív eredmény jelentene biztos eredményt. A továbbiakban más antitestek, ill. His-TAG ellenes antitest alkalmazásával kívánjuk igazolni a rekombináns fehérje jelenlétét. Nagyobb mennyiségű, tisztított sushi domén előállítása után lehetőség nyílik kötődési vizsgálatok (ELISA, felületi plazmon rezonancia) elvégzésére, az alegységek kapcsolódásáért felelős struktúra azonosítására.