Alfa-amilázok termékanalízisen és molekuláris modellezésen alapuló alhelytérképezése és transzglikozidáz aktivitásuk vizsgálata

A tétel rövid nézete
dc.contributor.advisorBagossi, Péter
dc.contributor.advisorHarangi, János
dc.contributor.authorMótyán, János András
dc.contributor.departmentMolekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskolahu
dc.contributor.submitterdepDE--OEC--Általános Orvostudományi Kar -- Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet
dc.contributor.submitterdepDE--TEK--Természettudományi Kar -- Biokémiai Tanszék
dc.date.accessioned2011-04-21T07:57:25Z
dc.date.available2011-04-21T07:57:25Z
dc.date.created2011hu_HU
dc.date.defended2011-05-13
dc.description.abstractA doktori értekezésben bemutatott munka során az aktív centrum térképezés módszerét használtuk a másodlagos kötőhelyeken módosított W279A, W278A/Y380A, W279A/Y380A, Y380A, H395A, H395A/Y380A és Y105A/Y380M AMY1 mutánsok vizsgálatára. Elvégeztük az aktív helyen módosított S48Y, V47A, V47F, V47D, V47K/S48G, V47G/S48D, V47L/S48A és V47I/S48I árpa α-amiláz 1 (AMY1) mutánsok alhelytérképezését. A megbízható alhelytérképek elkészítéséhez szükséges bontási képeket 3−11 tagszámú 2-klór-4-nitrofenil-β-D-maltooligoszacharid (CNP-β-D-MOS) szubsztrátsorozat segítségével határoztuk meg. Az alhelytérképek számításához a SUMA (Subsite mapping of α-amylases) számítógépes programot használtuk. Az AMY1 enzimek bontási képeinek meghatározása során a transzglikozilezési aktivitás növekedését tapasztaltuk, elsőként tanulmányoztuk részletesen az AMY1 és mutánsai transzferáz aktivitását. A reakciókörülmények optimalizálását követően elvégeztük a 4-metil-umbelliferil-α-D-maltooligoszacharidok (MU-α-D-MOS) enzimatikus szintézisét a V47F AMY1 mutáns által katalizált transzglikozilezés reakcióban. A 2−5 tagszámú MU-α-D-MOS szubsztrátokat sikeresen alkalmaztuk egy gyors és egyszerű fluorimetriás eljárásban, a Bacillus stearothermophilus maltózképző α-amiláz, a Bacillus licheniformis α-amiláz és a humán nyál α-amiláz kinetikai paramétereinek meghatározásában. A kidolgozott eljárás megoldást jelenthet a fluoreszcens α-amiláz szubsztrátok előállítására, melyek nem érhetők el kereskedelni forgalomban. Egy olyan számítógépes eljárást dogloztunk ki az α-amilázok vizsgálatára, mely az alhelytérképek molekuláris modellezéssel történő számításán alapul. A módszer kidolgozásához a különböző amilázok irodalmi adatai alapján létrehozott tanító halmazt használtuk, az eljárást a kísérletesen meghatározott és a jósolt értékek közötti korreláció alapján optimalizáltuk. Az ellenőrzéshez az AMY1 V47/S48 mutánsainak adataiból létrehozott ellenőrző halmazt használtuk, és a töltött aminosavak mutációval történő bevezetését tartalmazó mutáns enzimek kivételével szintén jó korrelációt kaptunk. A kidolgozott eljárás a vad típusú és mutáns enzimek homológ modelljeit használja az alhelytérképek Sybyl molekulamodellező szoftverrel történő molekulamechanikai számítására és a SUMA programot az elsődleges kísérletes adatok (BCF) jóslására. Módszerünk felhasználható lehet az α-amilázok szerkezet-funkció összefüggéseinek megértésében és a módosított fehérjék előállítására irányuló vizsgálatok támogatásában. In this work we used the method of subsite mapping to examine the W279A, W278A/Y380A, W279A/Y380A, Y380A, H395A, H395A/Y380A and Y105A/Y380M secondary substrate binding site mutants of AMY1. We mapped the active site of S48Y, V47A, V47F, V47D, V47K/S48G, V47G/S48D, V47L/S48A and V47I/S48I active site mutants of barley α-amylase 1 (AMY1). 2-Chloro-4-nitrophenyl-β-D-maltooligo-saccharides (CNP-β-D-MOS) of degree of polymerizaion (DP) 3−11 were used to determine the bond cleavage frequencies (BCF). Subsite binding energies were calculated using the computer program for subsite mapping of α-amylases (SUMA). Enhanced transglycosylation activity of several mutants of AMY1 was observed during the BCF analysis and this ability was further explored and studied systematically. After optimization of reaction conditions, 4-methylumbelliferyl-α-D-maltooligosaccharides (MU-α-D-MOS) of DP2−5 have been successfully synthesized using V47F active site mutant of AMY1. MU-α-D-MOS were used efficiently as fluorogenic substrates in a fast and simple fluorometric α-amylase assay to determine the kinetic parameters of Bacillus stearothermophilus maltogenic α-amylase, Bacillus licheniformis α-amylase and human salivary α-amylase. Described method may be the solution for preparation of fluorogenic α-amylase substrates which are not commercially available up to now. We developed a computer-aided subsite mapping procedure for α-amylases. A training set of data was collected from the literature using published data, to prepare a test set of data we determined experimentally the BCF-s and calculated the subsite maps of V47/S48 single and double mutants of AMY1. Parameters of the calculations were set up to get correlation between the calculated and the experimental binding energies of enzymes of a training set. Calculations on an independent test set also resulted in good correlation, except mutants containing neutral to charged residue substitution. Developed method was adopted for several α-amylases and is useful to calculate subsite binding energies of homologous models of wild-type and mutant enzymes by molecular mechanical program using Sybyl molecular modeling software as well as the primary experimental data (BCFs) with the use of computer program SUMA. Our computer-aided procedure may help to understand structure-function relationship of α-amylases and to design enzymes with new features.hu_HU
dc.format.extent91hu_HU
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/2437/104852
dc.language.isohuhu_HU
dc.language.isoenhu_HU
dc.subjectalfa-amilázhu_HU
dc.subjectalpha-amylasehu_HU
dc.subjectalhelytérképezéshu_HU
dc.subjectsubsite mappinghu_HU
dc.subjectbontási képhu_HU
dc.subjectaction patternhu_HU
dc.subjectkötéshasítási frekvenciahu_HU
dc.subjectbond cleavage frequencyhu_HU
dc.subjecttranszglikozilezéshu_HU
dc.subjecttransglycosylationhu_HU
dc.subjectmetil-umbelliferil-glikozidokhu_HU
dc.subjectmethylumbelliferyl-glycosideshu_HU
dc.subjectkemoenzimatikus szintézishu_HU
dc.subjectchemoenzymatic synthesishu_HU
dc.subjectalfa-amiláz akitivtás méréshu_HU
dc.subjectalpha-amylase assayhu_HU
dc.subjectmolekuláris modellezéshu_HU
dc.subjectmolecular modelinghu_HU
dc.subject.disciplineElméleti orvostudományokhu
dc.subject.sciencefieldOrvostudományokhu
dc.titleAlfa-amilázok termékanalízisen és molekuláris modellezésen alapuló alhelytérképezése és transzglikozidáz aktivitásuk vizsgálatahu_HU
dc.title.translatedExperimental and molecular modeling-aided subsite mapping of alpha-amylases and studies on their transglycosidase activityhu_HU
Fájlok
Eredeti köteg (ORIGINAL bundle)
Megjelenítve 1 - 8 (Összesen 8)
Nincs kép
Név:
Motyan_Janos_ertekezes.pdf
Méret:
3.45 MB
Formátum:
Adobe Portable Document Format
Leírás:
Az értekezés magyarul - Nem hozzáférhető
Letöltés
Nincs kép
Név:
Motyan_Janos_tezis_magyar.pdf
Méret:
428.07 KB
Formátum:
Adobe Portable Document Format
Leírás:
A tézisek magyarul - Nem hozzáférhető
Letöltés
Nincs kép
Név:
Motyan_Janos_tezis_angol.pdf
Méret:
352.19 KB
Formátum:
Adobe Portable Document Format
Leírás:
A tézisek angolul - Nem hozzáférhető
Letöltés
Nincs kép
Név:
Motyan_Janos_ertekezes.doc
Méret:
15.46 MB
Formátum:
Microsoft Word
Leírás:
Az értekezés eredeti formátumban - Nem hozzáférhető
Letöltés
Nincs kép
Név:
Motyan_Janos_meghivo.pdf
Méret:
134.48 KB
Formátum:
Adobe Portable Document Format
Leírás:
Meghivo
Letöltés
Nincs kép
Név:
Motyan_Janos_ertekezes.pdf
Méret:
3.44 MB
Formátum:
Adobe Portable Document Format
Leírás:
Az értekezés magyarul
Letöltés
Nincs kép
Név:
Motyan_Janos_tezis_angol.pdf
Méret:
356.85 KB
Formátum:
Adobe Portable Document Format
Leírás:
A tézisek angolul
Letöltés
Nincs kép
Név:
Motyan_Janos_tezis_magyar.pdf
Méret:
432.59 KB
Formátum:
Adobe Portable Document Format
Leírás:
A tézisek magyarul
Letöltés
Gyűjtemények
Molekuláris Sejt- és Immunbiológia Doktori Iskola