A mezotripszinogén proteolízisének és a hasnyálmirigy lipáz néhány természetes mutációjának vizsgálata

Dátum
Szerzők
Toldi, Vanda
Folyóirat címe
Folyóirat ISSN
Kötet címe (évfolyam száma)
Kiadó
Absztrakt
A krónikus hasnyálmirigy-gyulladás a humán hasnyálmirigy irreverzibilis gyulladásos megbetegedése, amelyet a proteázok idő előtti aktiválódása vagy a jelentős mennyiségben termelődő szekréciós fehérjék hibás feltekeredése okoz. A mezotripszin a humán hasnyálmirigy által termelt speciális sajátságokkal rendelkező minor tripszin izoforma, amely inhibitorokkal szemben rezisztens és képes bontani a tripszin inhibitorokat. A humán hasnyálmirigy egy tripszin inhibitort (SPINK1) is kiválaszt, amely késlelteti a tripszinogén aktivációját, ezáltal megakadályozza a hasnyálmirigy-gyulladás kialakulását. A SPINK1 mezotripszin általi lebontása a hasnyálmirigyen belül, hozzájárulhat a betegség patogeneziséhez. Feltételeztük, hogy egy minor kimotripszin izoforma (CTRC) proteolitikus hasításokkal inaktiválja a mezotripszint. Megállapítottuk, hogy a CTRC a mezotripszinogén autolízis hurok szakaszát a Leu148 és Phe150 pozícióknál hasítja. A hasított mezotripszin csökkent katalitikus aktivitással rendelkezik, amit igazol, hogy a rövid peptid szubsztrátok emésztése esetében egy nagyságrenddel nőtt az enzim Km értéke. A mezotripszin rosszul emésztette a kazeint és csökkent affinitással kötötte a szója tripszin inhibitort. Ezen felül a CTRC által hasított mezotripszin a SPINK1-et jelentősen csökkent hatékonysággal bontotta le. A közelmúltban ritka mutációkat azonosítottak a humán hasnyálmirigy lipáz (PNLIP) enzimben krónikus hasnyálmirigy-gyulladásban szenvedő betegekben és egészséges kontrollokban egyaránt. Feltételeztük, hogy négy szekréciós defektust mutató PNLIP variáns (A174P, G233E, C254R, V454F) ER stresszt indukál sejtes modellrendszerekben. Ismert, hogy a krónikus ER stressz károsíthatja a hasnyálmirigy acinus sejtjeit és hasnyálmirigy-gyulladást indukálhat. Eredményeink azt mutatták, hogy a jól szekretálódó vad típusú lipázzal ellentétben a lipáz variánsok nem szekretálódnak kondicionált médiumba. A PNLIP variánsok intracelluláris fehérje aggregátumokként felhalmozódtak a sejtekben, valószínűleg az ER-ben történő hibás feltekeredés miatt. A PNLIP mutánsok ER stresszt indukáltak, amit a processzált X-boksz-kötő fehérje 1 (XBP1) és az ER chaperon immunglobulin-kötő fehérje (BiP) megnövekedett mRNS szintje igazolt. Eredményeink azt mutatják, hogy a mezotripszin proteolitikus szabályozása megvédi a hasnyálmirigyet a nemkívánatos SPINK1 degradációtól. Továbbá a hibásan feltekeredett PNLIP variánsok hozzájárulhatnak a krónikus hasnyálmirigy-gyulladás kialakulásához.
Chronic pancreatitis is an irreversible inflammatory disorder of the human pancreas caused by premature protease activation or misfolding of highly expressed secretory proteins. Mesotrypsin is a unique minor secretory protease isoform of the human pancreas characterized by inhibitor resistance and its ability to degrade trypsin inhibitors. The human pancreas also secretes a pancreatic trypsin inhibitor (SPINK1), which delays the activation of trypsinogen and prevents the development of the inflammatory disorder pancreatitis. Intrapancreatic degradation of SPINK1 by mesotrypsin may contribute to the pathogenesis of the disease. We hypothesized that a minor chymotrypsin isoform (CTRC) inactivates mesotrypsin by proteolytic cleavages. We found that CTRC cleaves the autolysis loop of mesotrypsinogen at Leu148 and Phe150. Cleaved mesotrypsin exhibited catalytic impairment on short peptides due to a 10-fold increase in Km. Mesotrypsin digested casein poorly and bound soybean trypsin inhibitor with 10-fold decreased affinity. Importantly, CTRC-cleaved mesotrypsin degraded SPINK1 with markedly reduced efficiency. Recently, uncommon mutations in human pancreatic lipase (PNLIP) were identified in both cases with chronic pancreatitis and healthy controls. We hypothesized that four PNLIP variants (A174P, G233E, C254R, V454F) exhibiting secretion defect induce ER stress in cell culture models. Chronic ER stress may damage pancreatic acinar cells and cause pancreatitis. We found that in contrast to the readily secreted wild-type PNLIP, the lipase variants were undetectable in the conditioned media. PNLIP variants accumulated in the cells as intracellular protein aggregates probably due to misfolding in the ER. Consistent with this notion, PNLIP mutants induced ER stress, as indicated by increased mRNA levels of spliced X-box Binding Protein 1 (XBP1) and the ER chaperone Immunoglobulin Binding Protein (BiP). Our results demonstrate that proteolytic regulation of mesotrypsin protects the pancreas against undesirable SPINK1 degradation. Furthermore, misfolded PNLIP variants may contribute to the pathogenesis of chronic pancreatitis.
Leírás
Kulcsszavak
mezotripszin, kimotripszin C, proteáz, lipáz, genetikai rizikófaktor, ER stressz, hasnyálmirigy-gyulladás
Forrás