Differenciálódó porcsejtek feszültségfüggő kálium-csatornáinak molekuláris biológiai azonosítása

Abstract

A csirkeembriók végtagtelepeiből izolált kondrogenikus sejtekből létrehozott „high density” primer kultúrákban zajló porcdifferenciáció szabályozásában feltehetőleg fontos szerepet töltenek be a plazmamembrán különböző ioncsatornái. Kísérleteink során arra kerestük a választ, hogy a differenciálódó kondrogenikus sejtekben jelen vannak-e feszültségfüggő ioncsatornák és azok expressziós változásai korrelálnak-e a differenciáció lépéseivel. Munkánkban feszültségfüggő kálium csatornák (Kv) molekuláris biológiai azonosítását és azok porcképződésben betöltött szerepének felderítését tűztük ki célul. RT-PCR és Western blot segítségével a Kv1.3 és Kv4.1 csatornákat sikerült detektálnunk, ahol a Kv1.3 expressziója mind mRNS, mind fehérje szinten a differenciáció előrehaladtával folyamatosan emelkedik. A Kv4.1 csatorna a porcdifferenciáció kulcsfontosságú napjainak tekintett 2. és 3. tenyésztési napon expressziós csúcsot mutat. A membránfrakciókból készített Western blotokon azonban csak a Kv4.1 jelenlétét tudtuk igazolni. A csatornák porcdifferenciációban betöltöt szerepét a Kv csatornák specifikus farmakológiai gátlásával vizsgáltuk, ehhez 0,6 és 20mM koncentrációban a tenyésztés során folyamatosan adagolva tetra-etil-ammóniumot (TEA) használtunk. A porctelepek savas DMMK festését követően megfigyeltük, hogy mindkét koncentrációban alkalmazott TEA jelentősen gátolta a metakromáziásan festődő porcmátrix kialakulását. MTT teszttel megállapítottuk, hogy a sejtek életképessége nem csökkent, ugyanakkor 3H-timidin beépülése alapján proliferációs rátájuk jelentős mértékben visszaesett. A porcdifferenciáció mértékét jelző transzkripciós faktor, a Sox9 és foszforilált aktívabb formájának fehérje expressziója TEA hatására csökkent. A porcmátrix kialakításában kulcsfontosságú aggrekán és II. kollagén mRNS expressziója is csökkenést mutat. Az inhibitor hatására a Kv1.3 fehérjeexpressziója csökkenést mutat, míg a Kv4.1 esetében enyhe növekedést detektáltunk. Eredményeink alapján feltételezhető, hogy a Kv csatornák aktiválódása megváltoztatja a differenciálódó sejtek membránpotenciálját, amely (többek között) befolyásolja a sejtek osztódóképességét. További kutatásaink célja a Kv csatornák működéséhez köthető jelátviteli útvonalak azonosítása.