Vizsgálataink során a Thermobifida fusca TM51-es törzséből származó E. coli BL21(DE3) expressziós törzsében kifejezett rekombináns xilán 1,4-β-xilozidáz (TfBXyl43) enzim tisztítását biokémiai jellemzését, valamint működési mechanizmusának és aktív centrum topológiájának vizsgálatát végeztük el. Az enzim génjét egy pET28(a) vektor konstrukció tartalmazta, amelyet egy E. coli BL21(DE3) expressziós törzs hordozott. Az expressziót illetve a sejtek feltárását követően a fehérje tisztítását elsődlegesen affinitás kromatográfiával, ezt követően pedig anioncserés kromatográfiával valósítottuk meg. Az enzim hőmérséklet és pH optimuma 50 °C-nak és pH 6.0-nak adódott. A stabilitás vizsgálatok eredményei azt mutatták, hogy az enzim 60 °C-on (pH 6.0-on) valamint pH 4.5 és 5.5 (50°C-on) között részlegesen, míg 6.0-os és 7.0-es pH-n (50 °C-on) teljesen megőrzi stabilitását. Ezzel szemben pH 4.0-en (50 °C-on) nagyon instabilnak mutatkozott. Az elektroforetikus vizsgálatok bebizonyították, hogy az enzim rendelkezik negyedleges szerkezettel, amelynek során homotertamer formában jelenik meg, amelynek molekulatömege 240-250 kDa-nak, míg a monomer molekulatömege 61-62.5 kDa-nak adódott. A kinetikai vizsgálatok eredményei azt bizonyítják, hogy az enzim β-D-xilózt tartalmazó szubsztrátokat képes hidrolizálni (pNP-β-D-xilopiranozid, xilobióz), míg az α-L-arabinóz illetve β-D-glükóz tartalmú szubsztrátokat nem. A kinetikai paraméterek pH függése egyértelműen igazolja, hogy az enzim aktív centrumában, a katalitikus helyen egy deprotonált katalitikus nukleofil valamint egy protonált katalitikus sav/bázis együttes jelenlétére van szükség a hidrolízishez. A különböző xilooligomereken végzett vizsgálatok azt mutatták, hogy az enzim a xilotrióznál nagyobb polimerizációfokú oligomereket nem képes hdrolizálni. Az inhibíciós vizsgálatok eredményei egyértelműen azt igazolták, hogy az aktív centrum aglikon kötő része hidrofób karakterű, ahol döntően aromás aminosav oldalláncok vannak jelen, amelyek igen jelentős π-π kölcsönhatásokat képesek kialakítani az olyan szubsztrátokkal illetve inhibitorokkal, amelyek π elektronokkal rendelkeznek. Az enzimreakció sztereokémiájának 1H-NMR segítségével történő nyomon követése során bizonyítást nyert, az enzim inverziós mechanizmus szerint hasítja a szubsztrátját. A transzferáz aktivitás vizsgálataink azt az eredményt adták, hogy az enzim rendelkezik transzxilozilező aktivitással is. Az enzimnek mind az 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimiddal (EDAC), glicin metil észter jelenlétében mind pedig az N-brómacetil--D-xilopiranozil-aminnal (NBAXA) végzett kémiai módosítása egyaránt azt bizonyította, hogy az aktív centrumban a katalitikus sav/bázis módosult, ami egy karboxil csoportot tartalmazó aminosav oldallánc. A módosított enzim CD spektroszkópiai vizsgálata során egyértelműen kiderült, hogy az enzim másodlagos szerkezete rendezetlen irányba torzult az NBAXA-val történő inaktiválódás következtében.

The subject of our investigations was a recombinant xylan 1,4-β-xylosidase from Thermobifida fusca TM51 which was expressed in E. coli BL21(DE3) and was purified to apparent homogeneity by using affinity and anion exchange chromatography. The SDS-PAGE investigations demonstrated that the molecular weight of the monomer unit is 62.5 kDa but the native-PAGE studies indicated that the mass of the enzyme is 240-250 kDa which proves the presence of a characteristic homo oligomer quaternary structure in solution phase. Optimal parameters of the enzyme activity were at pH 6.0 and 50 °C. The enzyme showed little stability under pH 4.5 and above 60 °C. The substrate specificity investigations indicated that the enzyme is an exo-glycosidase, hydrolyzing only xylobiose and -triose from the nonreducing end. Besides the enzyme shows very high specificity on the glycon part of the substrate, since it can only hydrolyze β-D-xylopyranoside derivatives. The importance of hydrophobic interactions in the binding of the substrates are supported that the enzyme can hydrolize about four times more efficiently the artificial p-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside substrate compared to the natural one, xylobiose. Furthermore we could detect transxylosidase activity both in the case of xylobiose and p-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside donors which is the first example among the inverting xylan 1,4-β-xylosidases from Thermobifida fusca. The catalytic amino acid residues of the enzyme were investigated by direct chemical modifications. The pH dependence curves of the kinetic parameters gave pK values for the free enzyme, and pK values of for the enzyme–substrate complex respectively, by using an artificial substrate p-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside (pNP-Xyl). The detailed inhibition studies demonstrated well the hydrophobic character of the glycon binding site. Carbodiimide-mediated chemical modifications of the enzyme with 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDAC) in the presence of glycine methyl ester support the conclusion that a carboxylate residue can be fundamental in the catalytic process. We have also synthesized and tested N-bromoacetyl-β-D-xylopyranosylamine (NBAXA) for the enzyme as an affinity label, which also inactivated the enzyme irreversible. The pH dependence studies in both cases of inactivation revealed that the modified group is the catalytic proton donor which displays its essential role in the hydrolytic process. The β-D-xylopyranosylazide as competitive inhibitor protected the enzyme in all cases against the inactivation, suggesting that the chemical modification which has an impact on the activity took place in the active center. Changing of the enzyme conformation was followed by CD spectroscopy, as a result of the NBAXA inactivation. Our study is important because to our knowledge no similar investigations were made in the case of an inverting xylan 1,4-β-xylosidase.