A cisztein proteázok enzimmechanizmusát több ízben vizsgálták, mind kísérleti, mind pedig elméleti módszerekkel a papain példáján keresztül, azonban mind ez idáig nem került publikálásra olyan közlemény, melyben egyrészt a teljes enzimreakciót összefoglalóan tárgyalták volna, másrészt pedig a mechanizmust optimált, frekvenciaanalízissel igazolt stacionárius pontokkal jellemezték volna. Jelen munkában ONIOM-EE típusú hibrid számításokkal kívántuk vizsgálni a mechanizmus részleteit. A QM/MM számítások kvantumkémiai rétegjére a sűrűségfunkcionál módszereket alkalmaztuk és teljesítőképességüket is összehasonlítottuk. Számításaink alapján a semleges és az ionpár (tiolát-imidazólium) formában jelen lévő katalitikus diád közötti átmenet spontán gáz fázisú szimuláció szerint, melyet a szolvatáció az ionpár forma irányába tol el. Az acilezési lépést illetően koncertikus reakciót találtunk, melyben a cisztein tiolát kenének nukleofil támadása és az imidazólium formában jelen lévő hisztidin delta nitrogénjéről, a szubsztrát amid nitrogénjére történő protonátmenet erősen csatolt, de nem teljesen szinkronban történik. A peptidkötés hasadása csekély energiagáttal rendelkezik, külön részlépésnek tekintendő és csupán elméleti jelentőséggel bír. A kialakult acil-enzim intermedier hidrolízisének aktiválási gátja összemérhető az acilezési részlépés esetében szükséges energiamennyiséggel, ezen – szintén koncertikus – reakció eredményeként, megfelelő karbonsav termék és a regenerálódott aktív centrum marad vissza. A papain-szerű katalitikus, központi doménnel rendelkező humán transzglutaminázok, kalciumionok által indukált konformációs aktivációját két fehérje példáján keresztül tárgyaltuk. Ugyan meglehetősen jól konzerválódott másod- és harmadlagos szerkezet fedezhető fel a véralvadási kaszkád XIII-as faktorának A alegysége (FXIII-A) és a szöveti transzglutamináz (TG2) között, azonban a szekvenciahomológiáról ugyanez már nem mondható el, mely talán már előre vetíti azon diverz biológiai funkciókat, melyek ezen enzimekhez társíthatóak. Munkánk során első ízben tárgyaltuk mikroszekundumos molekuladinamika segítségével, ezen fehérjék aktivációjának azon korai fázisát, melyben a kalciumionok kötődése történik. Szimulációink azt mutatták, hogy az FXIII-A2 esetében korábban feltételezett gyengébb kötőhelyek valóban léteznek, melyek közül kiemelendő az alegységek ugyanazon aminosavai (Asp270, Asp271) által formált kötőhely. A TG2 szöveti transzglutamináz vizsgálatánál kiemelt figyelmet fordítottunk a korábban mutagenezis kísérletekkel felderített kalciumkötőhelyek vizsgálatára. A már azonosítottnak vélt zsebek vizsgálata mellett, egy új – a dinamikai szimulációk alapján - erősnek vélt kötőhelyet is azonosítottunk, mely feltehetően a mind ez idáig ismeretlen hatodik kötőhely.

The enzyme mechanism of cysteine proteases has been already investigated with both theoretical and experimental methods using papain as model system. However, by this time the full catalytic cycle was not studied in one place with the means of verified stationary points. In present work we used ONIOM-EE type hybrid calculations to explore the elementary step of the reaction mechanism and the effect of the choice of densitiy functional (including B3LYP functional) and basis set for the QM layer had been investigated. Based on our results, the transition between the neutral and the thiolate-imidazolium ion pair form of the catalytic diad is with in gas phase simulation and the solvation (treated by Poisson-Boltzmann solvation correction) pushes the equilibrium toward the ion pair form. We have found that the first acylation step of the studied mechanism is a concertic reaction in which the attack of thiolate nucleophile and the proton transfer from the imidazolium ring to the substrates amide nitrogen is strongly coupled, but not fully synchronous process (Proton coupled electron transfer, PCET). The cleavage of peptide bond possesses only a small energy barrier and its importance is only theoretical. The activation barrier regarding the hydrolysis of acyl-enzyme intermediate is comparable to the energy of the acylation step. This final step was found to be also concertic process which yield the corresponding carboxylic acid product and the regenerated active centre. The activation of human transglutaminases with papain-like catalytic core domain are clearly in connection with the presence of calcium ions, we presented the study of two human translgutaminases (FXIII-A2 and TG2) and the effects of the presence of calcium ions were deeply investigated. These two enzymes were the coagulation FXIII-A2 and the tissue transglutaminase (TG2). Both enzymes share highly conserved secondary and tertiary structures despite the relatively low sequence homology, the latter fact may predict the diverse biological functions of these enzymes. During our extensive, microsecond timescale, in silico molecular dynamics simulations, the calcium binding properties of these transglutaminases were carefully examined. Based on our results at least two new different binding sites had been identified beside the known main site of A subunits in the case of FXIII-A2. The importance of the binding site formed by the Asp270 and Asp271 residues of both main chains is highlighted. At the study of TG2 tissue transglutaminase our computational results had been compared to the existing in vitro experiments which based on site-directed mutagenesis. The most important finding was a new, strong, sixth calcium binding site of TG2.