Ioncsatornák szerepe egyes sejtfunkciók aktivációjában

Dátum
Folyóirat címe
Folyóirat ISSN
Kötet címe (évfolyam száma)
Kiadó
Absztrakt

Kísérleteink nyomán megállapításokat tehettünk sejtmembránbeli kationcsatornák receptorok és extracelluláris ozmolaritás általi szabályozásáról és ezek élettani szerepéről.

  1. A DDT1 MF-2 simaizomsejteken az A1 adenozin-receptor agonista CPA és az A2A adenozin-receptor agonista CGS 21680 ellentétes irányban változtatta meg a membránpotenciált. A1 és A2A antagonistákkal meg tudtuk akadályozni ezt a változást. A CPA alkalmazása dózisfüggő módon növelte sejteken mért kifelé irányuló feszültségfüggő káliumáramot, ezzel szemben a CGS 21680 csökkentette azt. Ennek alapján a káliumkonduktanciában bekövetkező változás tehető felelőssé a membránpotenciálbeli változásokért. A CGS 21680 dózisfüggő módon gyorsította a káliumcsatornálk inaktivációját. A pertussis-toxin alkalmazása nem befolyásolta a CGS 21680 káliumáram-blokkoló hatását, jelezve, hogy az A2A-agonista nem G-proteinen keresztül modulálja a csatornákat.
  2. Tengerimalac szöveteit vizsgálva, pitvari szívizomzatban és tüdőartériában mind az adenozin-receptor agonista NECA, mind a PET radiofarmakon analógja, az F-NECA koncentrációfüggő módon rendre a kontraktilis erő csökkenéséhez illetve fázisos kontrakcióhoz vezetett (A1-mediált hatás). Az F-NECA hatása mindkét szövetnél kisebb volt. A mellkasi aorta preparátumon és DPCPX-előkezelt tüdőartériákon a NECA és az F-NECA dózisfüggő módon relaxációt indukált, a két analóg között viszont itt nem adódott szignifikáns különbség. (A2B-receptor-mediált hatás). A DDT1 MF-2 sejteken mért feszültségfüggő káliumáramot mind a NECA mind az F-NECA szignifikánsan csökkentette és az áram inaktivációját is gyorsította. A kiváltott hatás azonban az F-NECA esetében kisebb volt. Fentiekből arra következtettünk hogy az F-NECA a NECA egy funkcionálisan kevésbé aktív analógja.
  3. A mechanikai feszülés-aktivált kationcsatornák szerepét vizsgáltuk abban a jelátviteli folyamatban, amely különböző fajok spermiumainak aktivációjához vezet. Ezeket a csatornákat gátolja a gadolinium, amely kísérleteink szerint a tengeri fugu és az édesvízi ponty spermájának motilitását dózisfüggő módon csökkentette. A fugu spermiumban található egyik fehérje izoelektromos pontjának a motilitás megindulásával járó eltolódását gátolta a gadolinium-kezelés. Ez a fehérje közvetítheti a feszülés-aktivált csatornák hatását. A fluoriméteres anizotrópia-méréseink során azt találtuk, hogy a ponty-sperma motilitását kiváltó hipoozmotikus kezelés növeli a membránfluiditást, a gadolinium viszont ezt megakadályozza. A feszülés-aktivált kationcsatornák tehát szerepet játszanak olyan fajok sperma-motilitásának megindításában, ahol a sperma eltérő ozmolaritású közegbe kerül a megtermékenyítéskor.
  4. A következő kísérletsorozatban ioncsatornák és receptorok együttállását vizsgáltuk humán T-limfóma sejtvonalon. A patch-clamp technika segítségével kimutattuk, hogy az MHC I, MHC II glikoprotein, IL-2Rα alegység, VLA-4 integrin és transzferrin sejtfelszíni receptorokhoz kötött 30 nm átmérőjű arany nanorészecskék különbözőképpen modulálják a Pi2 toxin Kv1.3 csatornákhoz történő kötődését. A moduláció a csúcsáramok exponenciális illesztésével nyert τin toxin-bemosási időállandó növekedésében mutatkozott meg a jelöletlen sejtekhez képest. Adatainkkal a Kv1.3 csatornák MHC-molekulákat tartalmazó raftokhoz való közelségét demonstráltuk. Az MHC I és MHC II már előzetesen igazolt közelségét felhasználva egy olyan kontroll-kísérletet végeztünk, melynek során az MHC I-hez kötött antitesteknek és aranygömböknek az (MHC II receptor-L243 antitest) kötődést térbeli leszorító hatását vizsgáltuk. Az L243-mediált csatornamodulációt ilyen módon sikeresen gátoltuk. Kidolgoztunk tehát egy olyan új módszert, mellyel receptor-csatorna vagy receptor-receptor proximitásokat tudunk detektálni, a koncentráció-ugrást követő, sztérikusan gátolt diffúzió elmélete alapján.

Modulation of ion channels by receptors has been described for many types of channels. This change can be a cause of intracellular phosphorylation or regulation by G-proteins, leading to complex alterations in channel current kinetics. Voltage-dependent potassium channels are suggested to mediate smooth muscle cellular functions upon binding of adenosine to its receptors. Adenosine-receptor agonists (i.e. NECA) and their radiolabelled derivatives (i.e. F-NECA) have already provided a suitable method to selectively investigate and visualize adenosine-receptors. These compounds also evoke different functional responses in tissues. Stretch-activated cation channels are expressed in various species and are highly sensitive to membrane tension and able to modify the activity of membrane proteins. Motility of spermatozoa of seawater and freshwater fishes are both initiated by change in extracellular osmolality. Stretch-activated channels are believed to provide Ca2+-influx for sperm activation. Lipid rafts organizing receptor clusters of MHC molecules on the surface of T-cells can be regarded as functional units of signaling. The same tyrosine and serine kinases involved in the regulation by IL-2 receptor were shown to be also coupled to MHC-elicited pathways. Voltage- and Ca2+-dependent K+ channels (among them Kv1.3 channels on T-cells) are among the main candidates responsible for maintaning a transmembrane potential window necessary for proper signal transduction. These ionic channels may directly or indirectly be coupled to the MHC- and IL-2R-containing lipid rafts. The aim of this study was to investigate the regulation of cell membrane cation channels by receptors and extracellular osmolality in certain tissues and cells. We wished to examine the effect of ligand binding to A1 or A2 adenosine receptors on the membrane potential and potassium conductance of smooth muscle cells. It was also a plan to compare the changes mediated by A1 and A2 receptors in the contraction and relaxation of certain tissues, caused by NECA and F-NECA, and their effects on the membrane potassium conductance in single cells. We also wished to examine the role of stretch-activated cation channels in the initiation of sperm motility of seawater and freshwater species, and aimed to investigate the physical proximity of Kv1.3 channels and cell surface receptors playing a role in the immune response on human T-lymphoma cells. In our experiments we observed that on DDT1 MF-2 smooth muscle cells A1 adenosine-receptor agonist CPA and A2A adenosine receptor agonist CGS 21680 inversely modulated membrane potential. With A1 and A2A antagonists we could prevent these changes. Application of CPA increased the voltage-dependent potassium current, in contrast, CGS 21680 decreased it. Changes in potassium conductance could be responsible for the alterations in membrane potential. CGS 21680 dose-dependently accelerated the inactivation of the potassium channels. The application of pertussis-toxin did not influence the effect of CGS 21680, indicating that this A2A-agonist does not modulate the channels via G-proteins. On guinea pig tissues, in atrial myocardium and pulmonary artery both adenosine-receptor agonist NECA and its PET radiotracer analogue F-NECA exerted a concentration-dependent reduction in contractile force and phasic contraction (A1-mediated effect). F-NECA had less effect for both kinds of tissue. On thoracic aorta preparations and DPCPX-pretreated pulmonary arteries NECA and F-NECA induced relaxation, however no significant difference was found between the two analogues (A2B-receptor mediated effect). Both NECA and F-NECA significantly decreased the voltage-dependent potassium current on DDT1 MF-2 cells, and accelerated the inactivation of the current as well. Nevertheless, the effect was less expressed for F-NECA. From the above one can conclude that F-NECA is a functionally less active analogue of NECA. Gadolinium, a mechanical stretch activated channel blocker, dose- dependently decreased the sperm motiliy of the seawater puffer fish and the freshwater carp. Gadolinium also inhibited the initiation-related shift in isoelectric point of a certain protein of puffer fish sperm. Our fluorimetric anisotropy measurements showed that hypoosmotic treatment, which initiates the motility of carp sperm, increases membrane-fluidity, while gadolinium prevents this. Therefore, stretch-activated cation-channels play a role in the activation of sperm-motility of species, where sperm gets into a medium with different osmolality at spawning. By using the patch-clamp technique on Kit 225 K6 cells, we demonstrated that golden nanobeads of 30 nm diameter bound to MHC I, MHC II glycoproteins, IL-2Rα subunit, VLA-4 integrin and TrfR cell surface receptors differently modulate the binding of Pi2 toxin to Kv1.3 channels. Modulation was seen in the increase of exponential τin toxin wash-in time constant compared to unlabelled cells. With our data we demonstrated the proximity of Kv1.3 channels to MHC-containing rafts. Taking into consideration the already proven vicinity of MHC I and MHC II we performed a control experiment in which the steric partition of (MHC II receptor-L243 antibody) binding was investigated by antibodies and golden beads bound to MHC I. This way L243-mediated channel modulation was successfully inhibited. We therefore evaluated a new method, with which we could detect receptor-channel or receptor-receptor proximities, on the basis of the steric partitioned diffusion, followed by a concentration-jump.

Leírás
Kulcsszavak
Forrás