Összefoglalás

A cholesteatoma a középfülben kialakuló ectopiás keratinózus ciszta, melyet lokálisan invazivitás jellemez, ami súlyos szövődményeket okozhat a középfülben. Leggyakoribb a hallócsontláncolati destrukció, halláscsökkenés, fülfolyás, szédülés, és az intracraniális szövődmények. A cholesteatoma terápiája annak műtéti eltávolítása, azonban még gondos műtéti eltávolítás után is a betegségnek magas a recidiva hajlama, főként a gyermekkori esetekben. Munkánk célja volt, a cholesteatomás megbetegedés hátterében álló genetikai, génexpressziós eltérések pontosabb, szélesebbkörű feltárása. Kísérleteink során revez transzkripciót követően quantitatív PCR módszerrel analizáltuk a cholesteatoma patomechanizmusában feltételezésünk szerint kulcsfontosságú szerepet játszó gének expressziójában bekövetkező változásokat. Munkánk sorn a cholesteatoma eseteket kor és klinikai adatok alapján felnőtt és gyermekkori csoportokra, majd mindkét betegcsoportot tovább kategorizáltuk szerzett (nem recidiváló, egyszeri) és recidiváló csoportokra.

Munkánk során a cholesteatomában detektált c-MYC protoonkogén expresszióját hasonlítottuk össze egy másik hisztológiailag hasonló keratinosus cisztában az atheromában (kásadaganat, epidermalis ciszta), valamint a normál bőrben mérhető értékekkel. A cholesteatomában szignifikánsan emelkedett volt a c-MYC expressziója az atheromához és a kontrollként használt normál bőrhöz képest. A kásadaganat a klinikumban nem okoz számottevő szövődményt ellentétben a cholesteatomával. Ezt az eltérő klinikai viselkedést a c-MYC protoonkogénnel kapott vizsgálati eredményeink részben magyarázhatják. Ezt követően a cholesteatoma mintákat tovább vizsgáltuk más tumor releváns gének – sejtciklust szabályozó fehérjét kódoló TP53, a citokeratin 1, 10 és 19 fehérjéket kódoló KRT1,10, és 19 gének, és egy mátrix metalloproteinázt kódoló gén, az MMP9 – mRNS szintjeinek mérésével.

A KRT1 és KRT10 gének expressziós szintjei nagyon hasonló mintázatokat mutattak a kontroll és beteg csoportokban, a KRT1/10 expresszió magasabb volt a gyermekkori recidiváló csoportban a kontroll csoporthoz és nem recidiváló gyermekkori esetekhez képest. A két gén fokozott expressziója folyamatos keratinocita differenciálódási és keratinizációs folyamatra utal, mely adataink szerint fokozottabb a gyermekkori recidiváló esetekben. A KRT1/10 komplex fokozott expressziója a jól differenciált fej-nyaki tumorokra is jellemző. A tumormarkerként gyakran vizsgált citokeratin 19 fehérje a legújabb kísérleti adatok alapján tumorszupresszor funkciót tölt be sejtekben. A nem recidiváló cholesteatomás esetekben magasabb volt a KRT19 gén expressziós szint, mint a recidiválóakban. Ez arra utal, hogy a recidiváló esetekben valószínűleg magasabb volt a sejtprolifeárció mértéke, mely rosszabb prognózist valószínűsít. Elsőként mértünk tehát olyan expressziós értékeket, amelyek ennek a citokeratinnak a cholesteatoma patomechanizmusában játszott szerepének fontosságát mutatják. A mátrix metalloproteináz 9 jelentős szereppel bír a tumor progresszióban, invazivitásban. Vizsgálatunkban az MMP9 expressziója szignifikánsan emelkedett volt a recidiváló esetekben, főként a felnőttkoriakban, amely fokozottabb invazitivást igazol. A TP53 gént vizsgálva szintén fokozottabb expressziót detektáltunk a recidiváló cholesteatomás esetekben, mely egy a sejtciklus zavarára utalhat. A recidiváló csoportok mintáiban az MMP9 és a TP53 gének esetében észlelt megemelkedett expressziós szintek a c-MYC protoonkogén emelkedett szintjével hozhatóak összefüggésbe, ugyanis a TP53 és MMP9 gének promoter szakaszán c-MYC kötőhely található. Az ismertetett esettanulmány pontosítja a recdiváló esetekre jellemző genetikai eltéréseket, melyek okozhatják a fokozottabb sejtproliferációt, invazivitási potenciált, és amelyek rosszabb prognózist valószínűsítenek. Kísérleteink során számos gén megváltozott expresszióját sikerült kimutatnunk, a detektált genetiai változások hozzájárulhatnak a cholesteatoma patomechanizmusa pontosabb megértéséhez, valószínűsítve a cholesteatoma neoplasztikus malformációját. Summary

Cholesteatoma is an ectopic keratinous cyst developing in the middle ear, which is characterized by local invasiveness that may cause severe complications in the middle ear. The most common complications are the destruction of the auditory ossicles, hearing loss, otorrhea, dizziness, and intracranial complications. The therapy of the cholesteatoma is its surgical removal. However, even after careful surgical removal, the disease has a high tendency to recurrence, especially in childhood cases. The objective of our study was to investigate the genetic and gene expression differences in the background of the cholesteatoma disease more precisely and more completely. During our experiments, after reverse transcription, the changes in the expression of the genes that, we assume, play a key role in the pathomechanism of the cholesteatoma were analyzed using quantitative PCR method. During our study, the cholesteatoma cases were categorized into adult and children groups based on age and clinical data, and then both groups were further subdivided into acquired (non-relapsing, single) and relapsing groups.

During our work, the expression of the c-MYC protooncogene detected in the cholesteatoma was compared with the values of another histologically similar keratinous cyst, the atheroma (epidermal cyst) and of the normal skin. The expression of the c-MYC in the cholesteatoma was significantly increased compared to the atheroma and the normal skin used as a control sample. Unlike the cholesteatoma, the epidermal cyst does not cause significant complications in the clinical practice. This difference in the clinical behaviour may partly be explained by the test results we have obtained which include the c-MYC protooncogene. Subsequently, we have examined the cholesteatoma samples further by measuring the levels of other tumour relevant genes – the TP53 encoding the cell cycle regulator protein, the KRT1, 10 and 19 genes that encode the citokeratin 1, 10 and 19 proteins, and the MMP9 – mRNA, a matrix metalloproteinase encoding gene.

The expression levels of the KRT1 and KRT10 genes showed very similar patterns in the control and patient groups, the KRT1/10 expression was higher in the childhood relapsing group compared to the control group and the non-relapsing childhood cases. The increased expression of the two genes indicates a continuous differentiation and keratinization process of the keratinocyte, which, based on our data, is more pronounced in childhood relapsing cases. The increased expression of the KRT1/10 complex is also typical of the well-differentiated head and neck tumours. According to the latest experimental data, the cytokeratin 19 protein, often studied as a tumour marker, has been shown to perform tumour suppressor functions in cells. In the non-relapsing cholesteatoma cases, the KRT19 gene’s expression level was higher than in the relapsing cases. This suggests that the degree of cell proliferation was probably higher in the relapsing cases, which suggests worse prognosis. Thus, we were the first to measure expression values that show the importance of this cytokeratin in the pathomechanism of the cholesteatoma. The matrix metalloproteinase 9 plays an important role in the tumour’s progression and invasiveness. In our study, the expression of the MMP9 was significantly increased in the relapsing cases, mainly in the adulthood cases, which suggests increased invasiveness. Studying the TP53 gene, we have also detected increased expression in the relapsing cholesteatoma cases, which may indicate cell cycle disorder. The elevated expression levels of the MMP9 and TP53 genes detected in the samples of the relapsing groups may be related to the elevated levels of the c-MYC proto-oncogene, because there is a c-MYC binding place on the promoter section of the TP53 and MMP9 genes. The presented case study clarifies the genetic abnormalities typical of the recurrent cases, which may cause increased cell proliferation, potential to invasiveness, and may suggest worse prognosis. During our experiments, we have managed to detect the altered expression of a number of genes, and the detected genetic changes may contribute to a more accurate understanding of the pathomechanism of the cholesteatoma, suggesting the neoplastic malformation of the cholesteatoma.