Annak ellenére, hogy a feszültségkapuzott káliumcsatornák (KV) kapuzásának strukturális alapjai, főbb lépesei és szabályozásának alapvető elemei ismertek, a kapuzási folyamat finomhangolását biztosító több tényező a megfelelő módszerek hiányában ezidáig feltáratlan maradt. Munkánk során ezért a KV csatornák aktivációs és C-típusú inaktivációs kapuzásának finomhangolását vizsgáltuk meg két fő kérdés mentén, új módszereket alkalmazva. Kimutattuk, hogy a membrán koleszterin és a 7-dehidrokoleszterin tartalmának emelése jelentősen módosítja a KV1.3 és a KV10.1 csatornák feszültségfüggő kapuzását jellemző egyensúlyi és kinetikai paramétereket. A kételektródás voltage-clamp fluorimetria technikát alkalmaztuk annak kiderítésére, hogy a membrán szterol koncentrációjának növelése az ioncsatorna feszültségszenzor doménjére (VSD) fejti-e ki hatását. Ezzel a technikával követni tudjuk a VSD mozgását az ionáram-mérésekkel egyidőben a kapuzási folyamat alatt a hozzá kapcsolt molekula fluoreszcencia intenzitásának változásán keresztül. Eredményeink azt mutatták, hogy a membrán szteroloknak nincs közvetlen hatása a VSD-re. A VSD és a pórus domén (PD) közötti csatolási apparátusra gyakorolt hatást többek között azzal zártuk ki, hogy a két vizsgált ioncsatorna esetén VSD és PD közötti csatolás különböző, KV1.3 esetén szoros, míg KV10.1 esetén e kapcsolat laza, a membrán szterolok hatása PD működésére viszont hasonló a két csatornában. Következtetésünk tehát, hogy a membrán szterolok elsődleges ioncsatornán belüli célpontja a PD, amit a szterolok hatása a csatorna vezetőképességre is megerősít.
A PD egyik kitüntetett szerkezeti eleme az aktivációs kapu (A-kapu), melynek működését állapotfüggő cisztein modifikációs és keresztkötési esszék alkalmazásával vizsgáltuk Shaker-IR csatornán, negatív membránpotenciálokon. Ez lehetőséget biztosít arra, hogy az A-kapu kinyílását kimutassuk a PD üregébe jutott Cd2+ és az ide stratégiailag beépített cisztein közötti kölcsönhatáson keresztül, ami a csatornán átfolyó áram csökkenésében nyilvánul meg. A módszerrel kimutattuk, hogy a csatorna A-kapujának kinyílása megelőzi a csatorna inaktivációját negatív membránpotenciálokon, azaz az egyensúlyi inaktiváció kialakulása során. A Shaker-IR csatornában a 476 pozícióban elhelyezett cisztein és egy a szomszédos alegységben található hisztidin közötti Cd2+-híd a csatorna A-kapuját nyitott állapotban rögzíti. Kísérleteink során az inaktivált csatornák A-kapuját Cd2+-híddal nyitott állapotban rögzítettük, ekkor a csatorna nem tér vissza az inaktivált állapotából tartós, -120 mV-os hiperpolarizáció mellett sem. Az A-kapu tehát kontrollálja azon negatív membránpotenciálokon végbemenő kapuzási átmeneteket (egyensúlyi inaktiváció, inaktivációból történő visszatérés), melyek a rendelkezésre álló káliumcsatornák számának kritikus meghatározói.

Although the structural foundations, main steps, and essential elements of the gating of voltage-gated potassium channels (KV) are known, several factors that ensure fine-tuning of the gating process have so far remained unexplored in the absence of proper methods. In our work, therefore, we examined the fine-tuning of activation and C-type inactivation gating of KV channels along two main issues applying modern biophysical methods. We have shown that increasing the cholesterol and 7-dehydrocholesterol content of the cell membrane significantly modifies the steady-state and kinetic parameters characterizing the voltage-dependent gating of KV1.3 and KV10.1 channels. We used the two-electrode voltage-clamp fluorometry technique to determine whether increasing the sterol concentration of the membrane affects the voltage sensor domain (VSD) of the ion channel. With this technique, the movement of the VSD can be tracked simultaneously with ion current measurements during the gating process through changes in the fluorescence intensity of the fluorophore attached to the top of the VSD. Our results showed that membrane sterols exert no direct effects on the VSD. Effects on the coupling apparatus between VSD and the pore domain (PD) were also ruled out by the fact that although the coupling between VSD and PD is different in the case of the two ion channels studied, i.e. it is tight in KV1.3 and loose in KV10.1, membrane sterols had similar effects on PD function in the two channels. Therefore we concluded that the PD is the primary target of membrane sterols within the ion channels, which was also confirmed by the effects of sterols on channel conductivities. One of the distinguished structural elements of the PD is the activation gate (A-gate), the operation of which we investigated using state-dependent cysteine modification and cross-linking assays in Shaker-IR channels at negative membrane potentials. This method makes it possible to detect the opening of the A-gate through the interaction between the Cd2+ entering the cavity of the PD and a cysteine strategically introduced here, which is manifested in a decrease in the current flowing through the channel. With this method, we showed that the opening of the A-gate precedes the inactivation of the channel at negative membrane potentials, i.e. during the development of steady-state inactivation. In the Shaker-IR channel, a Cd2+ bridge between the introduced cysteine at position 476 and a histidine of the adjacent subunit locks the A-gate of the channel in the open state. In our experiments, the A-gate of inactivated channels was locked in the open state with a Cd2+ bridge, subsequently, the channel did not recover from inactivation even at a prolonged hyperpolarization of -120 mV. Therefore, the A-gate controls the gating transitions (steady-state inactivation, recovery from inactivation) that are critical determinants of the number of available potassium channels at negative membrane potentials.