1. Bevezetés és irodalmi áttekintés

A stabil preokuláris könnyfilm az egészséges szem egyik jellemzője, ez képezi a látórendszerbe bejutó fény elsődleges törőfelületét, valamint védi és hidrálja a szaruhártyát. A könnyfilmnek három rétegét – két fázisát - különböztetjük meg: a szemfelszínt borító mucinréteg csökkenti a hámsejtek feltételezett hidrofób jellegét, a vizes réteg lubrikálja a szemfelszínt, tápanyaggal látja el és antibakteriális hatású, a lipidréteg megakadályozza a könnyfilm evaporációját. A könnyfilm szerkezetének feltárására az irodalomban különféle módszerekkel találkozhatunk, a hagyományos, fluoreszceinnel festett könnyfilm felszakadási idő (TBUT) és a Schirmer teszt alkalmazásától, a fluoreszceinnel festett szemfelszín rotátoros Scheimpflug képalkotó vizsgálatán át (Pentacam, Oculus, Németország) a szimultán fluoreszceinnel festett szemfelszín videós felvételéig, melyet a könnyfilm lipid rétegének képalkotó vizsgálatával kombinálhatnak. Az újdonságnak számító LacryDiag® (Quantel Medical, Franciaország) nevű eszköz számos nem-kontakt vizsgálattal diagnosztizálhatja a száraz szem szindórmát (DED), például az alsó könnymeniszkusz magasság mérésa (LTMH), a felső (MeibS) és az alsó (MeibI) szemhéj meibográfia, az interferometria (INT) és a nem invazív könnyfilm felszakadási idő (NIBUT) mérése. Az oxigén, a metabolitok és az elektrolitok mellett a könnyfilm antimikrobiális peptideket, fehérjéket és oldható immunglobulinokat tartalmaz, amelyek védik a szemfelszínt a fertőzésektől. A könnyet, mint testfolyadékot, széles körben vizsgálják a szembetegségek diagnosztizálására. A könny teljes fehérjekoncentrációja körülbelül 10 mg/ml, ami hozzávetőlegesen hétszer kisebb, mint a vérszérumban lévő fehérjéké. A könnyben található fehérjék, kis szerves molekulák, metabolitok, elektrolitok és lipidek potenciális biomarkerek lehetnek szemészeti és szisztémás betegségekben is. A modern proteomikai technikák érzékenysége több mint 1500 fehérje azonosítását tette lehetővé. A kvalitatív proteomikát - mely a fehérje mintában való jelenlétét azonosította, - a proteomikai platformok poszttranszlációs módosítások mérésére szolgáló mérőműszerek kifejlesztésével felváltotta a kvantitatív proteomika. Egyazon mintában több fehérje vizsgálatához azonban multiplex módszerekre van szükség. A kombinált módszereket alkalmazó megközelítések közé tartozik az antitest-alapú kimutatás és a kvantitatív polimeráz láncreakció (qPCR) kombinációja. A proximity extension assay (PEA) két, külön-külön nagy teljesítményű elemzési technika kombinálásával lehetővé teszi több fehérje relatív mennyiségi meghatározását nagyon kis mennyiségű (1µl) minta esetén, hatékony eszközt biztosítva a kis térfogatban rendelkezésre álló testfolyadékok elemzéséhez.

1. Célkitűzések

• Kutatásunk célja egy modern könnyfilm képalkotó eszköz megbízhatóságának és klinikai alkalmazhatóságának vizsgálata volt az inter- és intraobszerver különbségek összehasonlításával.

• Vizsgáltuk a hagyományos referencia módszer és a modern diagnosztikai eszköz különbségét a TBUT és a LacryDiag® készülékkel mért NIBUT összehasonlításával.

• A PEA módszer alkalmazásával kvalitatív és kvantitatív könnyanalízist végeztünk nem invazívan gyűjtött könnymintákban.

• A trabekulektómiát követő sebgyógyulási folyamatok pontosabb megértése céljából műtét utáni molekuláris eltérések analízisét végeztük, a lebeny komplikációkra fókuszálva.

1. Betegek és módszerek 3.1. Betegcsoportok 3.1.1. Betegcsoportok a képalkotó vizsgálatban Tanulmányunkat a Pécsi Tudományegyetem Klinikai Központ Szemészeti Klinikáján végeztük. A vizsgálatba bevont 50 egészséges önkéntes (20 férfi és 30 nő) a kutatás ideje alatt, illetve azt megelőzően nem szenvedett semmilyen általános vagy szemészeti betegségben, nem viseltek kontaktlencsét, valamint nem estek át intraokuláris vagy bármilyen típusú refraktív műtéten. A Helsinki Deklaráció elveinek megfelelően a bevonás előtt minden pácienst részletesen tájékoztattunk, majd írásos beleegyezésüket kértük a kutatásba. A kutatás a helyi etikai bizottság jóváhagyásával valósult meg. 3.1.2. Betegcsoportok a proteomikai vizsgálatban A könnymintákat a Debreceni Egyetem Szemklinikáján trabekulektómia műtéten átesett glaukómás betegektől gyűjtöttük. A mintavétel a Helsinki Deklarációnak megfelelően történt, a helyi etikai bizottság jóváhagyásával. A beválogatott 8 beteg (2 férfi és 6 nő) előzetes felvilágosítást követően írásos beleegyezését adta a könnyminta vételbe a trabekulektómia előtt (0. nap), a műtétet követő első napon, negyedik napon, illetve a posztoperatív harmadik hónapban. Egy esetben 3 hónapos mintavétel helyett 10. hónapos mintavétel történt. A pácienseket retrospektíven két csoportba soroltuk: „szövődményekkel járó” és „szövődménymentes” csoportokba attól függően, volt-e szükség szemnyomás csökkentő szemcsepp alkalmazására a posztoperatív első évben. Három beteg esetében nem értük el a cél IOP értéket a sebészeti beavatkozással, ezért gyógyszeres kiegészítésre volt szükség. A trabekulektómiát követően vizsgálatba bevont betegeknél korai posztoperatív szövődmény nem jelentkezett. Korai posztoperatív szövődménynek a következő eseményeket tartottuk: trabekuláris párna szivárgás, alacsony szemnyomás (hypotonia), hypheama, chorioidealis effúzió, vérzés vagy gyulladás (blebitis, endophtalmitis). Kizárási kritérium voltaz autoimmun kórképek, szisztémás gyulladásos állapotok, valamint a glaukómán kívüli egyéb szemfelszíni betegség együttes fennállása. 3.2. Klinikai vizsgálatok 3.2.1. Képalkotó vizsgálat Átfogó szemészeti vizsgálatot végeztünk: látásélesség mérést követően elülső szegmentum réslámpás vizsgálatot, LacryDiag®-ot (Quantel Medical, Franciaország) és TBUT mérést. A TBUT-t legalább 5 perccel a LacryDiag® vizsgálat után hajtottuk végre. Az eszköz által mért LTMH, MeibS, MeibI, INT és NIBUT paraméterek megfelelnek a TFOS DEWS 2 riport kritériumainak; ezért ezeket a nem-kontakt vizsgálatokat értékeltük tanulmányunkban. A LacryDiag® vizsgálatot és a TBUT mérést ugyanaz a tapasztalt vizsgáló orvos végezte minden beteg esetében. Két független, tapasztalt vizsgáló választotta ki és elemezte az LTMH-t, a MeibS-t, a MeibI-t és az INT-t. A második vizsgáló egy hónappal később újra elemezte az adatokat. A vizsgálat körülbelül 10 percet vett igénybe, és egyik páciens sem panaszkodott fájdalomról, kényelmetlenségről vagy látászavarról. A LacryDiag® készülékkel az LTMH mérése félautomata módon történik. A vizsgálat során a vizsgáló kaliperrel méri az alsó meniszkuszban összegyűlt könny magasságát. Elemzésünkhöz öt mérés átlagát használtuk. A Meib során a LacryDiag® készülék a Meibom-mirigyek infravörös leképezését és képelemzését alkalmazza, automatikus határfelismeréssel és szükség esetén manuális korrekciókkal. A technika a kifordított szemhéj fehér fény-átvilágításán alapul. A félautomata módszer során a műszer meghatározza a mirigy veszteség százalékos értékét, miután a vizsgáló manuálisan jelöli ki a vizsgálandó területet. Az INT a lipidréteg kvalitatív és kvantitatív elemzését jelenti. Ezzel a módszerrel a vizes fázis felszínén vékony rétegben kiterjedő olajos fázis mutatható ki. Az olajos fázis kinetikája és reflexiós mintázata alapján értékelhető a lipidréteg vastagsága. A könnyfilm ezen rétegét többnyire a Meibom-mirigyek termelik. A műszer lehetővé teszi a páciens szemfelszínéről készített videófelvételének referencia videókkal való összehasonlítását (7 előre elkészített videófelvétel). A NIBUT a könnyfilm stabilitását az evaporáció mértéke alapján határozza meg. Alapja a szemfelszínre vetített minta tükröződésének megfigyelése. A NIBUT szoftver automatikusan észleli a pislogást, rögzíti a két pislogás közti intervallumot és kiszámolja a NIBUT értékét. A vizsgáló teendője a felvétel megkezdésére és leállítására korlátozódik és osztályozási feladattal sem jár. A kézikönyv szerint, ha a pislogások közti intervallum eléri a 12 másodpercet, a felvételt le kell állítani. A statisztikai elemzéshez ordinális skálát alkalmaztunk a statisztikai torzítás csökkentése céljából. A két módszer összehasonlítása során a NIBUT és a TBUT ordinális skála cut-off értékének szakirodalom alapján 10 másodpercet határoztunk meg, azonban a NIBUT-nél 12, a TBUT-nél pedig 8 másodperces cut-off érték jobb diagnosztikai képességet mutatott, ezért mindkét cut-off értékkel elvégeztük a statisztikai számítást. 3.2.2. Proteomikai vizsgálat 3.2.2.1. Könnymintavétel A nem invazív könnygyűjtés steril üvegkapilláris csövekkel (VWR Ltd. Radnor, PA, USA) történt 2 percen keresztül az oldalsó alsó meniszkuszból, helyi érzéstelenítés és stimuláció alkalmazása nélkül. Centrifugálást követően (4°C-on 2,4xg-vel 10 perc) a felülúszókat öt µl-es aliquotákra osztottuk, mélyhűtöttük és -70°C-on tároltuk az elemzésig. A könnyminta vételt követően szemészeti vizsgálat történt (látásélesség vizsgálat, szemnyomás mérés, elülső és hátulsó szegmentum réslámpás vizsgálata). 3.2.2.2. Fehérjék relatív mennyiségi meghatározása Proximity Extension Assay segítségével A PEA vizsgálatokat az Olink Proteomics (Uppsala, Svédország) végezte. A gyulladásos és kardiovaszkuláris betegségek II (CVD II) panelek felhasználásával összesen 184 fehérje relatív kvantitálása történt meg. Előző kutatásaink alapján választottunk ki a vizsgálni kívánt fehérjéket. Ezek a fehérjék a gyulladásos panelben és a CVD II panelben voltak megtalálhatóak, ezért ezen két panelre esett a választás. Az egyes fehérjékre jellemző értékeket NPX egységekben, az Olink Proteomics által bevezetett relatív fehérje mennyiségi egységben kaptuk meg. 3.2.2.3. Funkcionális elemzés A minták több mint 30%-ában kimutatott fehérjék hierarchikus klaszterezését a Gene Cluster 3.0 (http://cluster2.software.informer.com/) programmal végeztük, valamint hőtérkép elemzést végeztünk a Java TreeView 1.1.6r4 verziójával. A klaszterezés előtt nem végeztünk szűrést vagy kiigazítást az adatokon, a távolság/hasonlósági mértékek a Pearson-féle korreláción alapultak, a klaszterezés pedig teljes kapcsolatelemzéssel történt. A kiválasztott fehérjék hálózatát a String 10.5 programmal rajzoltuk meg alapértelmezett beállítások és közepes szigorúság mellett és a véletlenszerű eloszláshoz képest nagyobb arányban reprezentált, azaz feldúsulást mutató gén ontológiai (GO) funkciókat kiemeltük. A String adatbázis egy könnyen használható eszközt biztosít a fehérje-fehérje kölcsönhatási hálózatok elemzéséhez, és információt ad a fehérjék szerkezetéről és funkciójáról. A statisztikailag szignifikáns változásokkal rendelkező fehérjék esetében Wikipathways kereső funkció segítségével útvonal elemzést végeztünk. (https://www.wikipathways.org/index.php/WikiPathways). Az útvonalak értékelése manuálisan történt.

3.3. Alkalmazott statisztikai módszerek 3.3.1. Képalkotó vizsgálat A statisztikai elemzést Intercooled Stata for Windows (13.0 verzió) segítségével végeztük. Minden esetben a jobb szem vizsgálati adatait használtuk fel. Leíró statisztika esetén az átlagot, a szórást (standard deviáció, SD) és az átlag 95% megbízhatósági tartományát (95% MT) adtuk meg. Az LTMH, a MeibS és a MeibI esetében osztályon belüli korrelációs együtthatók (intraclass correlation coefficient - ICC) kiszámítása történt a vizsgálók közötti és egy vizsgáló két elemzése közötti megbízhatóság megbecsülésére. A 0,4 alatti ICC rossz, az ICC 0,4 és 0,59 közötti értéke kielégítő, a 0,6 és 0,74 közötti eredmény jó, valamint 0,75 és 1,0 közötti érték kiváló megbízhatóságot jelez. Az INT, valamint a NIBUT és a TBUT közötti egyetértési mutató értékeléséhez ordinális kategóriájuk miatt súlyozott Cohen féle kappa-statisztikáját alkalmaztuk. A Cohen féle kappa együttható 0,2 alatti értéke alacsony, 0,21–0,40 kielégítő, 0,41–0,60 mérsékelt, 0,61–0,80 lényeges és 0,81–1,0 szinte tökéletes egyetértési mutatót jelent. Bland-Altman ábrázolást végeztünk a kiértékelések közötti különbségek vizualizálására és meghatároztuk az egyezőség határértékét (limits of agreement, LoA; átlagos különbség ± a különbség szórásának 1,96-szorosa). Ezen diagramokon a középső vonal jelzi az eszközök közötti átlagos különbséget, a felső és az alsó vonal pedig a 95% -os LoA értékeket. A p < 0,05 értéket határoztuk meg statisztikailag szignifikánsnak. 3.3.2. Proteomikai vizsgálat A két csoportra jellemző átlagos NPX-értékek összehasonlítására nem-parametrikus Mann-Whitney U-tesztet alkalmaztunk. A statisztikai elemzést az SPSS 25.0 (IBM Inc., USA) programmal végeztük. A műtét sikeressége és/vagy az idő relatív fehérjemennyiségekre gyakorolt hatásának vizsgálatához lineáris kevert modellt és varianciaanalízist (analysis of variance; ANOVA) alkalmaztunk az R program ImerTest funkciójának használatával, melyet az Olink (Svédország) cég végzett el. Az elemzésekbe nyolc különböző betegtől származó könnymintát vontunk be, melyeket öt különböző időpontban vettünk. A 30%-nál kisebb detektálhatóságú fehérjéket eltávolítottuk az elemzésből, így 138 fehérje analízise történt a 184-ből. Az időpontot és a szövődményeket fix hatásként vettük figyelembe, a vizsgálati alany azonosítóját véletlen hatásként vettük figyelembe. A vizsgálatba bevont betegek alacsony száma miatt a nemek hatását nem vizsgáltuk. A rögzített hatásra vonatkozó p-értékeket a szabadságfokok Satterthwaite-féle közelítésével becsültük és Benjamini-Hochberg módszerrel korrigáltuk. Minden szignifikáns vizsgálat esetében post hoc tesztet végeztünk a populációs átlag és a csoportok közötti páros különbségek becslésére. A post hoc p-értékeket a Tukey-módszerrel számoltuk ki.

1. Eredmények 4.1. Képalkotó vizsgálat A vizsgált ötven egészséges önkéntes TBUT mérése során az önkéntesek 15,6%-a 8 másodperc alatt és 28,12%-uk 10 másodperc alatt volt. A NIBUT mérése során a vizsgált személyek 28,12%-a 10 másodperc alatt, és 75%-uk 12 másodperc alatt volt. Az LTMH esetében mind az inter- mind az intraobszerver variabilitás kiváló volt (interobszerver ICC = 0,805; intraobszerver ICC = 0,868). Két vizsgáló között a MeibI ICC-érték gyenge volt (MeibI ICC = 0,464), azonban a MeibS ICC-érték jó volt (MeibS ICC = 0,666). A MeibI és a MeibS intraobszerver variabilitása kiváló volt (MeibI ICC = 0,760; MeibS ICC = 0,771) Az LTMH, a MeibI és a MeibS Bland-Altman-féle diagramjai a LoA-értékek nagyfokú variabilitását mutatják a csoportok között. A két vizsgáló között, valamint az egy vizsgáló két kiértékelése között az INT kiértékelésének egyetértési mutatója korrekt és mérsékelt volt (INT interobszerver érték = 0,301; p = 0,0002; INT intraobszerver értéke = 0,566; p <0,001), azonban az intraobszerver hasonlítás során az egyetértés mutatója magasabb volt. Az INT-hez tartozó Bland-Altman-diagramok a LoA nagyfokú variabilitását mutatják a csoportok között minden paraméter esetében. A NIBUT és a TBUT módszerek összehasonlítása során a különböző cut-off értékek esetén csekély volt az egyetértési mutató (NIBUT cut-off 12 mp. TBUT 8 mp: kappa koefficiens = 0,075; p = 0,099; NIBUT és TBUT cut-off 10 mp: kappa koefficiens = 0,054; p = 0,376).

4.2. Proteomikai vizsgálat

Könnyminta elemzés Proximity Extension Assay módszerrel

A könnymintákat az Olink Proteomics (Uppsala, Svédország) PEA-val elemezte a CVD II és a gyulladásos panelek alkalmazásával. Mindegyik panel 92 fehérjét és négy belső kontrollt tartalmazott, összesen 184 fehérjéről szolgáltatva információt. Az agyból származó neurotrofikus faktor vizsgálatával kapcsolatban technikai probléma adódott, ezért ezen fehérje elemzése nem volt kivitelezhető. Minden egyes mintához belső kontrollokat adtunk a vizsgálat és az egyes minták minőségének ellenőrzésére. A minőségellenőrzést (QC) két lépésben végeztük: i) minden mintalemezt a belső kontrollok SD értéke alapján értékeltünk és csak a minőségellenőrzésen átesett (SD <0,2 NPX) mintalemezek adatait vettük számításba, ii) az egyes minták minőségét a kontrollok medián értékétől való eltérésével értékeltük. Azok a minták, amelyek 0,3 NPX-nél kisebb mértékben térnek el a mediántól, átmentek a minőségellenőrzésen. Ez a CVD II esetében 60-ból 55, a gyulladásos panelek esetén 60-ból 57 fehérjét jelentett. A legtöbb fehérjét <5%-os variációs koefficienssel (CV) lehetett mérni, az intraassay CV jellemzően 4% volt. Fentiek alapján a PEA módszer megbízhatósága megfelelőnek és a könnyminták vizsgálatára is alkalmazhatónak bizonyult.

A fehérjeszint változások vizsgálata trabekulektómia után A két betegcsoport (szövődményes és szövődménymentes) eredményei között legalább 20% eltérést mutató fehérjéket a String hálózatelemző programba vezettük be. A szövődményes csoportba tartozó betegek mintáiban kisebb valószínűséggel megjelenő fehérjék hálózata 17 fehérjét tartalmazott. A von-Willebrand faktor hasító proteáz, az alfa-1-mikroglobulin/bikunin prekurzor, a kemokin (C-C motívum) ligand 3, a CD40 ligand, a CD84 molekula, szénsav anhidráz 5A, a 2,4-dienoil-CoA reduktáz 1, az IgG Fc fragmens alacsony affinitású receptora, a fibroblaszt növekedési faktor 23, a gyomor intrinsic faktor, a leptin, a kollagénszerkezetű makrofág receptor, a pitvari natriuretikus faktor, a renin, a trombopoetin, a tumor nekrózis faktor szupercsalád 14-es tagja és az UDP -glükóz glikoprotein glükozil-transzferáz 1 kisebb valószínűséggel található meg a szövődményekkel küzdő betegektől származó mintákban. 6 fehérje azonban nagyobb valószínűséggel volt jelen a szövődményes csoportban: az interleukin 17C, az interleukin 10 receptor alfta alegység, az interleukin 20 receptor alfa alegység, a 19-es fibroblaszt növekedési faktor, az artemin és a tumor nekrózis faktor szupercsalád 11-es tagja. A pontosabb elemzés érdekében a minőségi vizsgálatot mennyiségi elemzés követte. 184 fehérjéből 46 fehérje a minták kevesebb mint 30%-ban volt kimutatható, így ezeket a fehérjéket kizártuk a további statisztikai elemzésekből. A fehérjék relatív mennyiségének változásait hőtérképen tettük láthatóvá. Az adatok hierarchikus klaszterezése azt mutatta, hogy e fehérje mintázatok alapján a szövődményekkel járó csoport nem különíthető el egyértelműen a szövődménymentes csoporttól. Ugyanakkor 14 fehérje esetében nagyobb mennyiséget lehetett megfigyelni a szövődményekkel járó csoportba tartozó mintákban: kaszpáz 8, S100A12 fehérje, TNF szupercsalád 14-es tagja, monocita kemotaktikus fehérje 3, kemokin (C-C motívum) ligand 23, nukleáris faktor kappa-B esszenciális modulátor, karcinoembrionális antigénhez kapcsolódó sejtadhéziós molekula 8, spondin 2, szuperoxid-dizmutáz, glikoxaláz 1, oszteoklaszt-asszociált immunglobulinszerű receptor, poli-ADP ribóz-polimeráz-1, jelátvivő adapter molekula és eukarióta iniciációs faktor.

A nem-parametrikus Mann-Whitney U-teszt szerint kilenc fehérje mutatott statisztikailag szignifikáns különbséget a két csoport között: TNFRSF10A p=0,033; TNFRSF11A p=0,018; IL-18 p=0,014; polimer immunoglobulin receptor p=0,033; prolargin p=0,023; MMP12 p=0,016; IL8 p=0,03; MCP-1 p=0,023; CCL3 p=0,019. A PIGR kivételével valamennyi fehérje mennyisége növekedést mutatott a szövődményes csoportba tartozó mintákban. Az elemzés kevés kapcsolattal rendelkező hálózatot mutatott és a feldúsult útvonalak az immunválaszhoz kapcsolódtak.

Annak érdekében, hogy több információt kapjunk a sebgyógyulást szabályozó eseményekről és nyomon követhessük az idő és/vagy a szövődmények hatásait a relatív fehérjeszintekre, szigorú, mélyreható statisztikai elemzést végeztünk lineáris kevert modell segítségével. Ami az idő hatását illeti, az IL-6 és az MMP-1 szintje statisztikailag szignifikáns módon változott. Mindkét fehérje szintje statisztikailag szignifikáns módon emelkedett az első posztoperatív napon, magas maradt a második és a negyedik napon, majd három hónappal a műtéti beavatkozás után visszatért az eredeti szintre. A mintavételi napok közötti összehasonlítás tekintetében a változások statisztikailag szignifikánsak voltak. A szövődményekkel járó és a szövődménymentes csoport közötti változások statisztikailag nem voltak szignifikánsak. A technológiai fejlesztésekkel várhatóan mind a képalkotó eszközök mind pedig a biokémiai módszerek pontosabb és precízebb információkat fognak szolgáltatni a könny struktúrális és funkcionális változásairól, azonban további nagyobb esetszámú vizsgálatok szükségesek ezen módszerek széleskörű klinikai alkalmazását lehetővé tevő irányelvek kidolgozásához.

1. Főbb eredmények és következtetések

Lacrydiag® • A képalkotó vizsgálat során a vizsgálat ismételhetősége megbízható volt, és ez az LTMH esetében nagyon jó korrelációt mutatott a két vizsgáló között is. Ellenben a többi paraméter esetén jobb eredményeket kaptunk, ha a vizsgálatot ugyanazon személy végezte, ezért a követéses vizsgálatot javasolt egy szemésznek végeznie. • A NIBUT és a TBUT összehasonlításának enyhe egyetértési mutatója miatt érdemes a követést ugyanazon módszerrel végrehajtani. • A LacryDiag® műszer nyújtott vizsgálatok nem-invazívak, a vizsgálati eredmények video- és képrögzítésével standard módon segítik a beteg nyomon követését.

Proximity extension assay • Eredményeink azt mutatták, hogy a szövődményes betegcsoport mintáiban a sebgyógyulás különböző fázisaiban szerepet játszó fehérjék kvalitatív és kvantitatív szempontból is emelkedést mutattak a szövődménymentes betegcsoporthoz képest. Mindemellett több, elhúzódó sebgyógyulás esetén kis mennyiségben mérhető fehérje (pl.: GLO1, SOD2) szintjében is emelkedést tapasztaltunk. A sebgyógyulás zavartalan lefolyását reguláló fehérjék viszont ritkábban jelentek meg a szövődményes betegcsoport mintáiban. Összességében elmondható, hogy a könny fehérjéinek vizsgálatával következtetni lehet sebgyógyulás egyensúlyzavarának fennállására, mely késői műtéti komplikációkhoz vezethet. • Az immunválaszban és a sebgyógyulásban szerepet játszó fehérjék megváltozott mennyiségben és/ vagy gyakoriságban jelennek meg a műtétet követően a két betegcsoport között. • Elsőként vizsgáltunk könnymintát PEA módszerrel, adataink alapján a PEA alkalmas lehet több száz fehérje relatív mennyiségi meghatározására egyedi könnymintákban.

1. Introduction and literature review

A stable preocular tear film is a feature of a healthy eye, forming the primary refractive surface for light entering the visual system in addition to protecting and hydrating the cornea. Three layers (two phases) of the tear film are distinguished: the mucin layer, that covers the ocular surface, reduces the presumed hydrophobicity of the epithelial cells, the aqueous layer lubricates the ocular surface, provides it with nutrients and has antibacterial properties, and the lipid layer prevents evaporation of the tear film. Various methods to reveal the structure of the tear film are found in literature, ranging from conventional tests such as fluorescein tear break-up time (TBUT) and Schirmer test to the rotator Scheimpflug imaging study of the fluorescein-stained ocular surface (Pentacam, Oculus, Germany) and the simultaneous video imaging of the fluorescein-stained ocular surface, which can be combined with imaging of the lipid layer of the tear film. The novel device, LacryDiag® (Quantel Medical, France), can diagnose dry eye syndrome (DED) using a range of non-contact tests, such as measurement of lower tear meniscus height (LTMH), upper (MeibS) and lower (MeibI) eyelid meibography, interferometry (INT) and non-invasive tear break-up time (NIBUT). In addition to oxygen, metabolites and electrolytes, tear film contains antimicrobial peptides, proteins and soluble immunoglobulins that protect the ocular surface from infections. As a body fluid, tear is widely tested during the diagnostic work-up of ophthalmic diseases. The total protein concentration of tear is about 10 mg/ml, which is approximately seven times less than the serum protein level. Proteins, small organic molecules, metabolites, electrolytes and lipids in tear may be potential biomarkers for ophthalmic and systemic diseases. The sensitivity of modern proteomic techniques has enabled the identification of more than 1500 proteins. Qualitative proteomics, which can identify the presence of a protein in a sample, has been replaced by quantitative proteomics with the development of instruments used to measure post-translational modifications on proteomic platforms. However, multiplex methods are needed to analyze multiple proteins in the same sample. Approaches using combined methods include a combination of antibody-based detection and quantitative polymerase chain reaction (qPCR). By combining two separate high-throughput analytical techniques, proximity extension assay (PEA) allows the relative quantification of multiple proteins in very small sample volumes (1 µl), providing an efficient tool for the analysis of small volumes of body fluids.

1. Objectives

• The aim of our study was to investigate the reliability and clinical applicability of a modern tear film imaging device by comparing inter- and intraobserver differences.

• We examined the difference between the traditional reference method and the modern diagnostic tool by comparing TBUT to NIBUT measured with LacryDiag®.

• We applied the PEA method for qualitative and quantitative tear analysis in non-invasively collected tear samples.

• In order to make a better understanding of post-trabeculectomy wound healing processes, we analyzed the molecular abnormalities after surgery with focusing on flap complications.

1. Patients and methods 3.1. Patient groups 3.1.1. Patient groups in the imaging study Our study was carried out at the Department of Ophthalmology of the Clinical Center of the University of Pécs. The 50 healthy volunteers (20 males and 30 females) included in the study did not have any prior general or ophthalmological diseases, did not wear contact lenses, and did not undergo intraocular or any type of refractive surgery during or prior to the study. In accordance with the principles of the Declaration of Helsinki, all patients were informed in detail and their written informed consent was obtained prior to their inclusion. The research was approved by the local ethics committee. 3.1.2. Patient groups in the proteomics study Tear samples were collected from glaucoma patients who underwent trabeculectomy at the Department of Ophthalmology of the University of Debrecen. The sampling was performed in accordance with the Declaration of Helsinki and was approved by the local ethics committee. The 8 patients (2 males and 6 females) included in the study gave written informed consent for tear sampling before undergoing trabeculectomy (day 0), as well as on the first and fourth postoperative day, and in the third postoperative month. In one case, the sample was collected after 10 months instead of 3 months. Patients were retrospectively divided into two groups: “complications” and “no complications”, depending on whether they required the use of eye drops to reduce intraocular pressure in the first postoperative year. In three patients, surgical intervention failed to achieve the targeted IOP and therefore medicinal therapy was necessary. No early postoperative complications were reported in the patients studied. The following events were considered early postoperative complications: trabecular bleb leak, low intraocular pressure (hypotony), hyphema, choroidal effusion, hemorrhage or inflammation (blebitis, endophthalmitis). Exclusion criteria included concomitant diseases like autoimmune pathologies, systemic inflammatory conditions and non-glaucomatous diseases of the ocular surface. 3.2. Clinical trials 3.2.1. Imaging study Comprehensive ophthalmological examination was performed: visual acuity measurement was followed by anterior segment slit-lamp examination, LacryDiag® (Quantel Medical, France) and TBUT measurements. TBUT was performed at least 5 minutes after the LacryDiag ®test. LTMH, MeibS, MeibI, INT and NIBUT parameters measured by the device meet the criteria of the TFOS DEWS 2 report; therefore, these were the non-contact tests evaluated in our study. The LacryDiag® test and TBUT measurement were performed by the same experienced physician for each patient. Two independent experienced investigators selected and analyzed LTMH, MeibS, MeibI and INT. The second investigator re-analyzed the data one month later. The test took about 10 minutes and none of the patients complained of pain, discomfort or visual disturbance. With LacryDiag®, LTMH is measured semi-automatically. During the test, the height of the tear accumulated in the lower meniscus is measured by the examiner using a caliper. The average of five measurements was used for our analysis. During Meib, the LacryDiag® uses infrared imaging and image analysis of the Meibomian glands, with automatic border detection and manual corrections if necessary. The technique is based on white light transillumination of the everted eyelid. In the semi-automatic method, the instrument determines the percentage of gland loss after the examiner manually selects the area to be examined. INT is a qualitative and quantitative analysis of the lipid layer. This method allows the detection of a thin layer of oily phase on the surface of the aqueous phase. The kinetics and reflectance pattern of the oily phase allow the thickness of the lipid layer to be assessed. This layer of the tear film is mostly produced by the Meibomian glands. The instrument allows the comparison of video recordings of the patient's ocular surface with reference videos (7 pre-recorded videos). NIBUT determines the stability of the tear film based on the rate of evaporation. It is based on the observation of the reflection of a pattern projected to the surface of the eye. The NIBUT software automatically detects blinking, records the interval between two blinks and calculates the NIBUT value. The investigator's task is limited to starting and stopping the recording and does not involve any classification task. According to the manual, if the interval between blinks reaches 12 seconds, the recording should be stopped. For statistical analysis, an ordinal scale was used to reduce statistical bias. In comparing the two methods, the cut-off value for the ordinal scale of NIBUT and TBUT was set at 10 seconds based on the literature, but a cut-off value of 12 seconds for NIBUT and 8 seconds for TBUT showed better diagnostic ability, thus statistical calculations were performed with both cut-off values. 3.2.2. Proteomic analysis 3.2.2.1. Tear sampling Non-invasive tear collection was performed using sterile glass capillary tubes (VWR Ltd. Radnor, PA, USA) for 2 minutes from the lateral lower meniscus without the use of local anesthesia or stimulation. After centrifugation (at 4°C with 2.4 xg for 10 minutes), supernatants were divided into five µl aliquots, deep-frozen and stored at -70°C until analysis. After tear sampling, ophthalmic examination was performed (visual acuity, intraocular pressure measurement, slit-lamp examination of the anterior and posterior segments). 3.2.2.2. Relative quantification of proteins by proximity extension assay PEA studies were performed by Olink Proteomics (Uppsala, Sweden). Using the inflammatory and cardiovascular disease II (CVD II) panels, relative quantification of a total of 184 proteins was performed. We selected the proteins to be tested based on our previous research. These proteins were found in the inflammation panel and the CVD II panel, and therefore these two panels were chosen. The values for each protein were obtained in NPX units, the relative protein abundance unit introduced by Olink Proteomics. 3.2.2.3. Functional analysis Hierarchical clustering of the proteins detected in more than 30% of the samples was performed using Gene Cluster 3.0 (http://cluster2.software.informer.com/) and heatmap analysis was performed using Java TreeView v1.1.6r4. No filtering or adjustment was performed on the data prior to clustering, distance/similarity measures were based on Pearson's correlation, and clustering was performed using full correlation analysis. The network of selected proteins was plotted using String 10.5 with default settings and medium stringency, and gene ontology (GO) features with higher representation (i.e., enriched) compared to the random distribution were highlighted. The String database is an easy-to-use tool for analyzing protein-protein interaction networks and provides information on protein structure and function. For proteins with statistically significant changes, pathway analysis was performed using the Wikipathways search function. (https://www.wikipathways.org/index.php/WikiPathways). Pathways were assessed manually.

3.3. Statistical methods used 3.3.1. Imaging study Statistical analysis was performed using Intercooled Stata for Windows (version 13.0). In all cases, examination data from the right eye were used. For descriptive statistics, mean, standard deviation (SD) and 95% confidence interval (95% MT) of the mean were reported. For LTMH, MeibS and MeibI, intraclass correlation coefficients (ICC) were calculated to estimate interobserver and intraobserver reliability. An ICC below 0.4 indicates poor reliability, an ICC between 0.4 and 0.59 indicates satisfactory reliability, a result between 0.6 and 0.74 indicates good reliability, and a result between 0.75 and 1.0 indicates excellent reliability. Weighted Cohen's kappa statistic was used to evaluate the agreement index between INT and NIBUT and TBUT due to their ordinal category. Cohen's kappa coefficient values indicate low (below 0.2), satisfactory (0.21–0.40), moderate (0.4–0.60), substantial (0.61–0.80) or almost perfect (0.81–1.0) agreement. Bland-Altman plots were used to visualize the differences between the evaluations and to determine the limits of agreement (LoA; mean difference ± 1.96 × the standard deviation of the difference). In these plots, the middle line indicates the mean difference between instruments and the top and bottom lines indicate the 95% LoA values. A value of p <0.05 was defined as statistically significant. 3.3.2. Proteomic analysis A non-parametric Mann–Whitney U-test was used to compare the mean NPX values for the two groups. Statistical analysis was performed using the SPSS 25.0 program (IBM Inc., USA). To examine the effect of surgical outcome and/or time on relative protein levels, linear mixed model and analysis of variance (ANOVA) were applied using the ImerTest function of the R program. It was performed by Olink (Sweden). Tear samples from eight different patients, taken at five different time points, were included in the analyses. Proteins with less than 30% detectability were removed from the analysis, resulting in the analysis of 138 proteins out of 184. Time and complications were considered as fixed effects, subject ID as a random effect. Due to the small number of patients included in the study, the effect of gender was not examined. Fixed effect p-values were estimated using Satterthwaite's approximation of degrees of freedom and corrected using the Benjamini–Hochberg method. For all significant examinations, post hoc tests were performed to estimate the population mean and pairwise differences between groups. Post hoc p-values were calculated using the Tukey method.

1. Results 4.1. Imaging study Of the fifty healthy volunteers tested, 15.6% of the TBUT measurements were under 8 seconds and 28.12% were under 10 seconds. When measuring NIBUT, 28.12% of subjects were under 10 seconds and 75% were under 12 seconds. For LTMH, both inter- and intraobserver variability were excellent (interobserver ICC = 0.805; intraobserver ICC = 0.868). Between two examiners, MeibI ICC was poor (MeibI ICC = 0.464), but MeibS ICC was good (MeibS ICC = 0.666). The intraobserver variability of MeibI and MeibS was excellent (MeibI ICC = 0.760; MeibS ICC = 0.771) The Bland–Altman plots of LTMH, MeibI and MeibS show a high degree of variability in LoA values between groups. Between the two examiners and between two examinations of the same examiner, the agreement index for INT evaluation was fair and moderate (INT interobserver value = 0.301; p = 0.0002; INT intraobserver value = 0.566; p <0.001), but the agreement index was higher for the intraobserver comparison. Bland–Altman plots for INT show a high degree of variability in LoA between groups for all parameters. When comparing the NIBUT and TBUT methods, there was little agreement for different cut-off values (NIBUT cut-off: 12 sec and TBUT: 8 sec: kappa coefficient = 0.075; p = 0.099; NIBUT and TBUT cut-off: 10 sec: kappa coefficient = 0.054; p = 0.376).

4.2. Proteomic analysis Tear sample analysis with proximity extension assay

Tear samples were analysed by Olink Proteomics (Uppsala, Sweden) with PEA using CVD II and inflammatory panels. Each panel contained 92 proteins and four internal controls, providing information on a total of 184 proteins. A technical problem was encountered with the analysis of brain-derived neurotrophic factor, so analysis of this protein was not feasible. Internal controls were added to each sample to control the analysis and the quality of each sample. Quality control (QC) was performed in two steps: i) each sample plate was evaluated based on the SD of the internal controls and only those sample plates that passed the QC (SD <0.2 NPX) were included, ii) the quality of each sample was evaluated by the deviation of the median value of the controls. Samples that deviated from the median by less than 0.3 NPX passed the quality control. It occurred for 55 out of 60 proteins for CVD II and 57 out of 60 for the inflammatory panels. Most proteins could be measured with a coefficient of variation (CV) of <5%, with intraassay CV typically being 4%. Based on the above, the reliability of the PEA method was found to be adequate and applicable to the analysis of tear samples.

Examination of protein level changes after trabeculectomy Proteins with at least a 20% intergroup difference (between “complications” and “no complications” group) were introduced into the String network analysis program. The network of proteins less likely to occur in the samples of patients in the “no complications” group contained 17 proteins. von Willebrand factor–cleaving protease, alpha-1-microglobulin/bikunin precursor, chemokine (C-C motif) ligand 3, CD40 ligand, CD84 molecule, carbonic anhydrase 5A, 2,4-dienoyl-CoA reductase 1, low affinity receptor for IgG Fc fragment, fibroblast growth factor 23, gastric intrinsic factor, leptin, collagen macrophage receptor, atrial natriuretic factor, renin, thrombopoietin, tumor necrosis factor superfamily member 14 and UDP-glucose:glycoprotein glucosyltransferase 1 are less likely to be found in samples from patients with complications. Six proteins, however, were more likely to be present in the “complications” group: interleukin 17C, interleukin 10 receptor subunit alpha, interleukin 20 receptor subunit alpha, fibroblast growth factor 19, artemin and tumor necrosis factor superfamily member 11. For a more accurate assessment, qualitative analysis was followed by a quantitative analysis. Out of 184 proteins, 46 proteins were detected in less than 30% of the samples and were excluded from further statistical analysis. The changes in the relative abundance of proteins were visualized on a heat map. Hierarchical clustering of data showed that these protein patterns did not clearly distinguish the “complications” group from the “no complications” group. However, for 14 proteins, higher abundances were observed in samples of the “complications” group: caspase 8, S100A12 protein, TNF superfamily member 14, monocyte chemotactic protein 3, chemokine (C-C motif) ligand 23, nuclear factor kappa-B essential modulator, carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 8, spondin 2, superoxide dismutase, glyoxalase 1, osteoclast-associated immunoglobulin-like receptor, poly-ADP ribose polymerase-1, signal transducing adaptor molecule and eukaryotic initiation factor. Nine proteins showed statistically significant differences between the two groups according to the non-parametric Mann–Whitney U-test: TNFRSF10A p=0.033; TNFRSF11A p=0.018; IL-18 p=0.014; polymer immunoglobulin receptor p=0.033; prolargin p=0.023; MMP12 p=0.016; IL8 p=0.03; MCP-1 p=0.023; CCL3 p=0.019. The amount of all proteins except PIGR were increased in the samples from the “complications” group. The analysis showed a network with few connections and the enriched pathways were associated with the immune response.

In order to obtain more information about the events that regulate wound healing and to track the effects of time and/or complications on relative protein levels, we performed a rigorous, in-depth statistical analysis using a linear mixed model. Regarding the effect of time, IL-6 and MMP-1 levels changed in a statistically significant manner. Both protein levels increased in a statistically significant manner on the first postoperative day, remained high on the second and fourth day, and returned to the original level three months after surgery. The changes were statistically significant for comparison between sampling days. Changes between the “complications” and “no complications” groups were not statistically significant. With technological advances, both imaging tools and biochemical methods are expected to provide more accurate and precise information about structural and functional changes in tear, but more case-control studies are needed to develop guidelines for the widespread clinical use of these methods.

1. Main results and conclusions Lacrydiag® • The repeatability of the imaging technique was reliable, in addition the LTMH has shown excellent interobserver accuracy as well. However better results were achieved in the case of the other parameters, if the examination was performed by the same investigator. These results suggest that follow-up examinations of patients should be performed by the same ophthalmologist. • The slight disagreement of the NIBUT and TBUT comparisons suggests that follow-up should be performed with the same method. • The LacryDiag® instrument provides a non-invasive, standard way to help monitor the patient by video and image recording of test results.

Proximity extension assay • Our results showed that in the samples of the “complications” group, proteins involved in different phases of wound healing showed an increase in both qualitative and quantitative aspects compared to the “no complications” group. In addition, we observed an increase in the levels of several proteins that can be measured at low levels in case of prolonged wound healing (e.g., GLO1, SOD2). However, proteins that regulate the normal progression of wound healing were less abundant in the samples of the “no complications” group. In conclusion, the analysis of tear proteins suggests the existence of wound healing imbalances that may lead to late surgical complications. • Proteins involved in immune response and wound healing are detected in different amounts and/or frequency after surgery between the two groups of patients. • We were the first to test tear samples using PEA, and our data suggest that PEA can be used to quantify the relative abundance of hundreds of proteins in individual tear samples.