A proteázoknak jelentős szerepe van különböző fertőző megbetegedések kialakulásában, példaként említhető a különböző vírusok replikációs ciklusához nélkülözhetetlen proteázoknak a vírus érést elősegítő funkciója, ezért fontos ezen enzimek szerkezeti felépítésének és működésének részletes megismerése. A kutatócsoportunk által kidolgozott, proteolitikus enzimek vizsgálatára alkalmas rekombináns fluoreszcens fehérje szubsztrát rendszer alkalmazását alapul véve célul tűztük ki a HIV-1 proteáz (PR) szubsztrát-specificitásának vizsgálatát a HIV-1 nukleokapszid proximális cink-ujj motívumában lévő hasítóhelyet reprezentáló szubsztrátokkal, valamint a szubsztrátok konformációs állapotainak vizsgálatát. Mindezek mellet célunk volt a SARS-CoV-2 fő proteáz (Mpro) ismert és in silico módszerekkel jósolt hasítási szekvenciáit tartalmazó szubsztrátok vizsgálata, az enzim gazdasejt szubsztrátjainak azonosítása céljából. Továbbá, célkitűzéseink közé tartozott a rekombináns fehérje szubsztrátok használatán alapuló, újszerű méréstechnikai módszer kidolgozása, a proteolitikus hasítás valós idejű detektálására alkalmas mérési módszer kidolgozása révén. A HIV-1 PR vizsgálata során elvégeztük a különböző nukleokapszid hasítóhelyet reprezentáló szubsztrátok hasítási hatékonyságainak összehasonlító vizsgálatát, mely során a legnagyobb mértékű szubsztrát-konverziót az N17F mutáns esetében tapasztaltuk, eredményeink összhangban vannak a korábban oligopeptid szubsztrátokon meghatározott aminosav preferenciákkal. A szubsztrátok konformációs állapotainak vizsgálata során megállapítottuk, hogy a HIV-1 PR nem hasította a cink-ujj motívumot cink ion jelentétében, míg a szupermásodlagos szerkezet kialakulását megakadályozó EDTA és DDT jelenlétében processzálást tapasztaltuk. A SARS-CoV-2 Mpro vizsgálata során igazoltuk, hogy az enzim az ismert és a jósolt hasítóhely szekvenciákon belül egyaránt képes hasítani a vizsgált szubsztrátokat. Sikeresen azonosítottuk a hasítási pozíciókat a szekvenciákon belül, majd enzimkinetikai méréseket végeztünk a szubsztrát-specificitás vizsgálata érdekében. Munkánk eredményeként azonosítottuk a SARS-CoV-2 Mpro egy korábban ismeretlen szubsztrátját, a humán CTBP1 fehérjét, valamint a fehérjében lévő új hasítóhelyet, melyet az enzim kisebb hatékonysággal hasított a SARS-CoV-2 poliprotein egy autoproteolitikus hasítóhely szekvenciájához képest. A rekombináns fluoreszcens fehérje szubsztrátokat felhasználtuk egy új, a proteolitikus aktivitás mérésére alkalmas, bioréteg interferometria-alapú módszer kidolgozására. A mérés körülményeinek optimalizálását követően a módszert sikeresen alkalmaztuk a HIV-1 PR specificitásának tanulmányozása során, valamint igazoltuk az enzimfelszíni szubsztrátkötő árok szerepét a szubsztráttal való kölcsönhatások kialakításában. Módszerünk segítheti a BLI ezen új felhasználási lehetőségének elterjedését, mert lehetővé teszi a proteáz aktivitás valós idejű mérését kis térfogatban és nagy áteresztőképességű rendszerekkel is kompatibilis.

The proteases play a crucial role in the development of various infectious diseases, for example, the viral maturation-promoting function of proteases is necessary for the completion of the replication cycles of various viruses, therefore, it is important to understand the structure and functiona of these enzymes in details. Based on the use of a recombinant fluorescent protein substrate system - designed previously by our research group - we aimed to investigate the substrate specificity of HIV-1 protease (PR) using substrates representing a cleavage site of the proximal zinc finger motif of the HIV-1 nucleocapsid and to study the conformational states of the substrates. In addition, we aimed at the investigation of substrates containing known and in silico-predicted cleavage site sequences of the SARS-CoV-2 main protease (Mpro). In addition, our aim was to develop a novel experimental approach for the examination of proteolytic activity real-time, based on the use of recombinant protein substrates. In the case of HIV-1 PR, we performed a comparative in vitro study of the cleavage efficiencies of different substrates and found that the highest degree of substrate conversion was observed for the N17F mutant, our results are consistent with the amino acid preferences previously determined on oligopeptide substrates. The examination of the substrate’s conformational states revealed that HIV-1 PR is not able to cleave the zinc finger motif in the presence of zinc ion, while we observed processing in the presence of EDTA and DDT, which prevented the formation of a supersecondary structure. Our studies on SARS-CoV-2 Mpro demonstrated that SARS-CoV-2 Mpro can cleave substrates within both known and predicted cleavage site sequences. We successfully identified cleavage sites within the sequences and performed enzyme kinetic measurements to test substrate specificity. As a result of our work, we identified a previously unknown substrate of SARS-CoV-2 Mpro, the human CTBP1 protein, and a novel cleavage site in the protein that was cleaved by the enzyme with lower efficiency compared to the autoproteolytic sequence of the SARS-CoV-2 polyprotein. The recombinant fluorescent protein substrates were used to develop a novel, biolayer interferometry-based method for measuring proteolytic activity. After optimization of the measurement conditions, the method was successfully applied to study the specificity of HIV-1 PR and to demonstrate the role of the enzyme surface’s binding sites (substrate groove) in the formation of interactions with the substrate. Our method may help to expand this novel application of BLI because it allows real-time measurement of protease activity in small volumes, and is compatible with high-throughput systems.