A doktori értekezésemben felhasznált munkáink során elvégeztük a BLV PR részletes enzimológiai vizsgálatát és a kapott eredmények alapján jellemeztük más retrovirális proteázokkal (elsősorban a HTLV-1 és HIV-1 enzimekkel) öszehasonlítva. A retrovírusok HTLV/BLV családjába tartozó BLV proteolitikus enzimjének tanulmányozása során felépítettük a proteáz számítógépes modelljét. Megvizsgáltuk a BLV PR szubsztrátspecificitását retrovírusokban előforduló természetes hasítási helyeket tartalmazó oligopeptid szubsztrátokkal. Szemben a HTLV-1 proteázzal, és hasonlóan a HIV-1 proteázhoz, a BLV PR képes volt bontani a peptidek többségét (általában az eredeti hasításnak megfelelő aminosav mellett), széles specificitást jelezve. További specificitásvizsgálatokat végeztünk az erre alkalmasnak bizonyult, HTLV-1 2-es típusú CA/NC hasítási helyen alapuló, egyszeres aminosavrész-cseréket tartalmazó oligopeptid szubsztrátsorozaton. A BLV PR tág szubsztrát-toleranciáját ezen kísérletsorozat is megerősítette, mind a 42 oligopeptidet el tudta hidrolizálni, ráadásul a P2 helyen lizint és a P1’ helyen aszpartát cserét tartalmazó peptideken kívül kkat/KM ≥ 1 mM-1s-1 hatékonysággal. A BLV PR szubsztrátkötő régiója kevésbé kiterjedtnek bizonyult, mint a HTLV-1 proteázé. Bár mindkét enzim a nagyobb, hidrofób aminosavrészeket kedvelte S2, S1 kötőhelyein, a BLV PR sokkal inkább elfogadta a hidrofil, sőt töltött oldalláncokat is. A kritikus S2 zsebet kiemelve megállapíthatjuk, hogy a specificitás szempontjából a méret meghatározó, de a zsebet alkotó hidrofilebb aminosavrészek hozzájárulásának köszönhetően a BLV PR meglehetősen jól tolerálta a poláros aminosavrész-cseréket is. Mindazonáltal, legtöbb tekintetben a BLV PR egyedi szubsztrátkötő zsebeinek specificitása a HTLV-1 proteázéhoz áll közel, összhangban a zsebeket valószínűsíthetően felépítő aminosavrészek (a HIV-1 proteolitikus enzimjéhez képest) nagyobb fokú hasonlóságával. Kísérleteink folytatásaként HIV-1 PR felé mutató mutációkat hoztunk létre a BLV PR szubsztrátkötő zsebeiben. Több aminosavrész-csere feltekeredésre képtelen és/vagy inaktív fehérjét eredményezett, komoly mutációs érzékenységre utalva, ahogyan ezt a HTLV-1 PR esetében szintén, de valamivel kifejezettebben, a HIV-1 PR esetén pedig kevésbé tapasztalták. Teszteltük a BLV proteázt különböző retrovirális proteázok ellen tervezett inhibitorokkal is. Figyelemre méltó, hogy a BLV PR fogékonyabb a vizsgált gátlószerekre, mint a HTLV-1 (köztük a HTLV-1 ellen tervezettekre is). Úgy tűnik, e tulajdonság összefüggésben van a BLV proteázra általánosan alacsonyabbnak mért KM értékekkel. Az enzimek működése szempontjából kritikus szerepet betöltő S2 szubsztrátkötő zsebre szűkített vizsgálatainkban mért enzimaktivitások és kinetikai állandók, valamint a felépített molekuláris modellek tanulmányozása alapján azt a következtetést vonhatjuk le, hogy a BLV PR S2 szubsztrátkötő helye viszonylag nagy (a P2 Leu csere bizonyult a legjobbnak), de az előző kísérletsorozattól eltérően számottevő poláros aminosavrész-preferenciát nem tapasztaltunk. Ez az eltérés arra utal, hogy a retrovirális proteázok szubsztrátspecificitása erősen függ a hasítási hely környezetétől. Általánosságban azt mondhatjuk, hogy a főemlős (HIV-1, HIV-2, SIV) lentivírus proteázok kivételével az S2 zseb specificitása alapvetően méretfüggő és ez a tulajdonság a legtöbb esetben a természetes hasítási hely szekvenciákban is tükröződik. Az aminosavrész-kedvezményezettségek alapján olyan filogenetikai vírus-csoportok különülnek el, melyek jól követik a proteáz-szekvencia illesztés alapján felépített törzsfa menetét, de nem esnek annak csoportjaival pontosan egybe. Összességében elmondhatjuk, hogy a mutációkkal és a gátlószerekkel szembeni érzékenységük alapján, a specificitásbeli különbségeik ellenére, a BLV és a hozzá kapcsolódó állatkísérletes rendszer jó modellnek bizonyulhat HTLV-1-t célzó inhibitorok kipróbálásához. Bízunk benne, hogy ezen értekezésben foglaltak érdemben hozzájárulnak a retrovirális proteázok szubsztrátspecificitásának jobb megértéséhez, amely segítséget nyújthat olyan széles hatástartományú inhibitorok tervezésében, melyek sikeresen gátolják a gyógyszeres kezelés hatására megjelenő, életképes HIV-1 proteáz mutánsokat.

During my Ph.D work I had the opportunity to study the BLV proteinase in details and to compare its features with other retroviral proteases (mainly with HIV-1 and HTLV-1 proteases).
We built a molecular model of the BLV PR. The specificity of the BLV PR was characterized using a large set of oligopeptides representing naturally occurring cleavage sites in various retroviruses. Based on the results, the BLV PR appears to have a broad substrate specificity, similar to HIV-1 PR, but unlike the related HTLV-1 PR. The broader specificity of the BLV PR, compared to the HTLV-1 PR, was also verified by mapping the individual substrate binding sites using a set of oligopeptides with single amino acid substitutions. Furthermore, the substrate binding site of BLV PR appeared to be less extended compared to that of HTLV-1 PR. While both BLV and HTLV proteases showed a preference for larger hydrophobic P2 and P1 residues, BLV PR much better tolerated hydrophilic or even charged residues at these positions. Nevertheless, in most aspects the specificity of individual subsites of BLV PR more closely resembled that of HTLV-1 PR, in good agreement with the more similar sets of residues predicted to be involved in substrate binding, as compared to those of HIV-1 PR. It appears to be a common characteristic of BLV and HTLV-1 proteases that their folding capability and/or catalytic efficiency are much more sensitive towards mutations than many other retroviral proteases, especially HIV proteases. Inhibition profile of the BLV PR resembles more to that of HTLV-1 PR as compared to HIV-1 PR. However, BLV PR was substantially better inhibited as compared to the HTLV-1 PR. This effect appears to correlate with the generally lower Km values observed for BLV PR as compared to HTLV-1 PR. The specificity of the critical S2 substrate binding site of the proteases of eleven retroviruses representing each of the seven genera of retroviridae was studied using a series of oligopeptides having amino acid substitutions in P2 position. Despite the previous experiment, when we employed oligopeptides based on naturally occurring type 2 cleavage site sequences, the S2 binding site of BLV PR appeared to be a relatively large pocket and a preference for Leu was observed, without considerable hydrophilic residue tolerance. However, it is important to note that the specificity of retroviral proteases appears to be strongly context dependent, as reviewed for HIV-1 PR. The specificity distinction of the proteases correlated well with the phylogenetic tree of retroviruses prepared solely based on the PR sequences. Molecular models for all studied proteases were built, and they were used to interpret the results. While size complementarities appear to be the main specificity-determining features of the S2 subsite of retroviral proteases, electrostatic contributions may play a role only in case of HIV proteases. In most cases the P2 residues of naturally occurring type 1 cleavage site sequences of the studied proteases agreed well with the observed P2 preferences. In conclusion, based on our studies, despite the specificity differences, in terms of mutation intolerance and inhibitor susceptibility of the PR, BLV and the corresponding animal model systems may provide good models for the test of PR inhibitors that would be developed by in vitro studies against the protease of HTLV-1. Understanding the specificity similarities and differences of the retroviral enzymes may help to design broad-spectrum inhibitors against HIV-1 PR.