Porcszövet – primer, HD sejttenyészetek Mint azt előző közleményünkben ismertettük, a szabad citoplazmatikus [Ca2+] megemelkedése a primer kondrogenikus sejtek differenciálódása során, Ca2+-beáramlás következménye és ezen jelenség alapvetően fontos a csirke mesenchymalis HD sejttenyészetek porccá történő differenciálódásában. Jelen munkánkban igazoltuk, a chondrogenikus sejtek differenciálódás során történő ATP szekrécióját. ATP adagolása a sejteken Ca2+-tranzienseket váltott ki extracelluláris Ca2+ jelenlétében, mely csak a tenyésztés 3. napján volt megfigyelhető, amikor a chondroblastok végleges elkötelezettsége megtörténik. Ezen túlmenően az ATP-nek a sejtek tápoldatához történő hozzáadása következtében fokozódott a chondrogenikus transzkripciós faktor (Sox9) expressziója, valamint az extracelluláris porcmátrix termelődése. A suramin alkalmazása, amely gátolja az összes P2X-receptort, - a P2X4-kivételével - nem védte ki az ATP hatását, ezenkívül a P2X4- a 3. napon megjelent a plazmamembrán frakcióban és ugyanezen napon erős pozitivitást mutatott immuncitokémiai jelöléssel is. Bár P2X1-, P2X4-, P2X5- és P2X7-típusú ionotróp purinoreceptorok mellett, a P2Y1-, P2Y3- és P2Y5- metabotróp purinoreceptorok mRNS-szintű, valamint a P2Y1-, P2Y2- és P2Y4- fehérjeszintű expressziója is kimutatható volt a sejteken. A metabotróp P2Y1-purinoreceptor agonista ADP és P2Y6- agonista UDP alkalmazása szintén nem eredményezett Ca2+-tranzienseket a HD tenyészetek sejtjeiben és nem indukált fokozott mátrix képződést sem. Másrészről a P2Y2- és P2Y4- agonista UTP adagolását követően kis amplitúdójú Ca2+-tranziensek megfigyelhetőek voltak, de ezen nukleotid sem fokozta a porcmátrix termelődését a chondrogenezis folyamán.. Mindezen adatok alapján feltételezzük a P2X4 receptor szerepét az ATP-függő intracelluláris [Ca2+] emelkedésben a primer chondroblast-differenciálódás során. Vázizomszövet in vitro vázizomtenyészetek Bár a triadin-nak a Ca2+-homeosztázisban betöltött szerepét napjainkban többen tanulmányozzák, nem áll rendelkezésre irodalmi adat arra vonatkozóan, hogy a Trisk 95 fehérje túltermelése, illetve expressziójának csökkentése vagy gátlása milyen hatással van a lokális, elemi Ca2+-felszabadulási eseményekre. Jelen munkánkban az ECRE-t és a Ca2+-tranzienseket tanulmányoztuk konfokális lézer mikroszkóp segítségével C2C12 izomsejteken és primer vázizomtenyészeteken. Liposzóma és adenovírus mediált overexpressziót, valamint RNS-interferencia módszert alkalmaztunk a Trisk 95 fehérje expressziójának módosítására. A stabil overexpresszió csökkentette mind a Ca2+ sparkok amplitúdóját és frekvenciáját, mind a depolarizáció által kiváltott Ca2+-tranzienseket C2C12 sejtekben. Ehhez hasonlóan, a Trisk 95 adenovírus mediált overexpresszióját követően csökkent a spontán, egész sejtre kiterjedő Ca2+-tranziensek amplitúdója és előfordulási gyakorisága is. Ugyanakkor az endogén triadinexpresszió shRNS-el történő gátlása ellentétes változásokat eredményezett. Kontroll, endogén Trisk 95-öt expresszáló patkány, primer vázizomtenyészetekben rendre megfigyelhetőek voltak spontán Ca2+-tranziensek, viszont ezen tenyészetek sparkokat csak kis gyakorisággal generálnak. Az shRNS transzfekciót követően a Trisk 95-specifikus immunpozitivitás jelentősen csökkent. Ezen sejteken történő funkcionális mérések alapján a koffeinnel kiváltott Ca2+-tranziensek jellemzően csökkentek, ugyanakkor az ECRE-k jelentősen nagyobb gyakoriságot mutattak. Ezen eredmények alapján feltételezhető, hogy a Trisk 95 fehérje negatívan szabályozza a RyR működését, azáltal, hogy csökkenti a lokalizált, elemi Ca2+-felszabadulási eseményeket, valamint a globális Ca2+-tranzienseket vázizomtenyészetekben.

Primary, HD cultures In vitro chondrogenesis is a dynamic, multistep process regulated by a variety of molecular processes, many of which involve activation and deactivation of protein kinases and phosphatases sensitive to changes of intracellular [Ca2+]. In chicken HD mesenchymal cell cultures, chondrogenic mesenchymal cells differentiate into chondroblasts and then to chondrocytes during a 6-day-long culturing period. The majority of chondroblasts, characterised by the ability of production of a cartilage specific ECM, appear from culturing day 3. We have previously demonstrated that elevation of free cytosolic [Ca2+] at the time of differentiation of chondroblasts was mainly due to a Ca2+-influx and it was indispensable to cartilage formation in chicken HD mesenchymal cell cultures. In the present work we describe, that chondrogenic cells secreted ATP during the differentiation period. Administration of ATP to the culture medium evoked Ca2+-transients exclusively in the presence of extracellular Ca2+ and mostly on day 3 of culturing, when the final commitment of chondroblasts occurs. Moreover, ATP caused elevated protein expression of the chondrogenic transcription factor Sox9 and ATP also stimulated cartilage matrix production. Administration of suramin, which blocks all P2X receptors but not P2X4 did not impede the effects of ATP, furthermore, P2X4 appeared in the plasma membrane fraction and gave signals with immunocytochemistry only from day 3. Expressions of both ionotropic purinergic receptors P2X1, P2X4, P2X5 and P2X7 and metabotropic purinergic receptors P2Y1, P2Y3 and P2Y5 at the mRNA level and P2Y1, P2Y2 and P2Y4 at the protein level were detected. Among the agonists of the metabotropic receptors, ADP and UDP did not evoke any Ca2+-transients in HDC and had no influence on cartilage formation. On the other hand administration of UTP resulted in transient elevation of cytosolic Ca2+ concentration in 3-day-old HDC but did not stimulate matrix production during the chondrogenesis. Based on these data, we suggest a role of P2X4 in the generation of ATP-dependent Ca2+-transients of differentiating chondroblasts.

Skeletal muscle cultures The 95 kDa triadin (Trisk 95), an integral protein of the sarcoplasmic reticulum membrane in skeletal muscle, interacts with both the ryanodine receptor (RyR) and calsequestrin. While its role in the regulation of Ca2+-homeostasis has been extensively studied, data is not available on whether the overexpression or the interference with the expression of Trisk 95 would affect Ca2+ sparks the localized, elementary Ca2+-release events (ECRE). In the present study ECRE and Ca2+-transients were studied using laser scanning confocal microscopy on C2C12 cells and on primary cultures of skeletal muscle. Liposome or adenovirus-mediated Trisk 95 overexpression and shRNA interference with triadin translation were used to modify the level of the protein. Stable overexpression in C2C12 cells significantly decreased the amplitude and frequency of Ca2+ sparks, and the frequency of embers. In line with these observations, depolarisation-evoked Ca2+-transients were also suppressed. Similarly, adenoviral transfection of Trisk 95 into cultured mouse skeletal muscle cells significantly decreased both the frequency and amplitude of spontaneous global Ca2+-transients. Inhibition of endogenous triadin expression by RNA interference caused opposite effects. Primary cultures of rat skeletal muscle cells expressing endogenous Trisk 95 readily generated spontaneous Ca2+-transients but rarely produced Ca2+ sparks. Their transfection with specific shRNA sequence significantly reduced the triadin-specific immunoreactivity. Functional experiments on these cells revealed that while caffeine-evoked Ca2+-transients were reduced, ECRE appeared with higher frequency. These results suggest that Trisk 95 negatively regulates RyR function by suppressing localized Ca2+-release events and global Ca2+- signals in cultured muscle cells.