A króm hatása a Chlorella pyrenoidosa néhány anyagcsere-folyamatára

Az élőlények számos olyan terhelésnek vannak kitéve környezetükben, melyek aktivitásukat, fejlődési folyamataikat, lehetőségeiket korlátozzák. Ezeket a terheléseket egyrészt természetes abiotikus, másrészt biotikus, míg harmadrészt antropogén eredetű (pl. nehézfémek) tényezők váltják ki. Mindezek a hatások - összefoglaló néven a stresszorok - olyan rövid és hosszú távú válaszokat váltanak ki a szervezetekben, amelyek létrehozzák az egyed életében túlélést biztosító akklimációt és akklimatizációt; a több nemzedék során kialakuló tartós ellenálló képességet, adaptációt, és ennek eredményeként a rezisztenciát. A különböző stresszorok által kiváltott stresszválaszok egyes esetekben teljesen specifikusak más esetekben általános válaszok következnek be. Figyelembe véve, hogy a növények esetében egy-egy generáció viszonylag hosszú életű, valamint többségük helyhez kötött, az akklimáció szerepe rendkívül fontosnak tűnik. Mind a talaj, mind pedig a felszíni és felszín alatti vizek szennyezésében komoly gondot okoznak az oldható nehézfém ionok és ezek különböző szervetlen komponensekkel képzett komplex vegyületei. Az ipar által kibocsátott nehézfém szennyezőket részletesen elemezték makro-, illetve mikroökológiai szempontok alapján, kevésbé ismertek azonban a nehézfém ionok által okozott molekuláris hatásmechanizmusok. A vizekben előforduló szennyező ágensek elsősorban az algák és más mikroorganizmusok életműködését befolyásolják, bár a jól detektálható károsodásokat gyakran csak összetettebb szervezetekben vesszük észre. Nehézfém okozta stresszek esetében jellegzetes változások lépnek fel a fotoszintetizáló élőlényekben (plazmamembrán-károsodások, oxigéngyökök képződése, szabad fémionok jelennek meg a citoszolban, tápanyagfelvételi-, vízháztartásbeli-, fotoszintetikus zavarok, növekedésgátlás, csökkent virág- és magképződés), melyek egy része közvetlen, míg másik részük közvetett hatásokra vezethető vissza. Kísérleteinkben arra voltunk kíváncsiak, hogy egy lokálisan, a környezetbe gyakran nagy mennyiségben kikerülő toxikus nehézfém - a króm - milyen módon és milyen mértékben befolyásolja egy jól ismert zöldalga faj - a Chlorella pyrenoidosa - egyes anyagcsere folyamatait. Vizsgálatainkhoz a krómot választottuk, mert az élőlényekre gyakorolt hatásainak molekuláris mechanizmusa kevéssé ismert, feltárása jelenleg is folyamatban van. Az algák felhasználásával újabb lehetőségek kínálkoznak mind az indikáció, mind pedig az akkumuláció és elimináció folyamatában. A különböző algafajok gyakran nagy mennyiségben képesek felhalmozni nehézfémeket. Ezeknek a nehézfémeknek a felvétele és megkötése közben gyakran olyan redoxfolyamatok játszódnak le bennük, amelyek az adott fémiont kevésbé oldható, élőlények számára kevésbé hozzáférhető formába alakítják át. Vizsgálataink közvetett módon választ keresnek arra is, hogy egy - nehézfémekkel szennyezett - vizes élőhely restaurációjában milyen módon használhatók fel a zöldalgák. Munkánk során a Cr(VI) hatását vizsgáltuk a Chlorella pyrenoidosa zöldalga szaporodására és a nehézfém-stresszekre jellemző, fontosabb anyagcsere folyamataira.

Fő célkitűzéseink a következők voltak:

• Milyen módon befolyásolja a Cr(VI) a Chlorella pyrenoidosa zöldalga szaporodását, növekedését és biomasszájának változását?
• Képesek-e a zöldalga sejtek akkumulálni a krómot, illetve milyen ennek a sejten belüli megoszlása? Milyen tendenciájú változások történnek a sejtek mikroelem-összetételében Cr(VI) kezelés hatására?
• Hogyan változik meg a sejtek fotoszintetikus pigment összetétele, ill. mintázata, valamint az összes aminosav és különösen a stresszfiziológiai szempontból jelentős prolin tartalma Cr(VI) kezelés hatására?
• Milyen mértékben változik a fotoszintézis hatékonysága? Közvetlen, vagy közvetett hatásokra vezethetők-e vissza ezek a változások, illetve milyen változások következnek be a szénhidrát-anyagcserében és milyen metabolikus, enzimatikus következmények tapasztalhatók?
• Hogyan változik a nehézfém terhelések hatására várhatóan fellépő oxidatív stresszt kontrolláló oxidoreduktázok - kataláz, peroxidázok - aktivitása?
• Jelennek-e meg speciális nehézfém kötő proteinek (fitokelatinok), illetve indukálódnak-e a szintézisükhöz szükséges enzimek Cr(VI) terhelés hatására? A dolgozatban egy toxikus nehézfém ion, a Cr(VI) - Cr(III) mellett - hatását vizsgáltuk a Chlorella pyrenoidosa zöldalga néhány anyagcsere folyamatára. A Chlorella pyrenoidosa kedvelt és gyakori tesztorganizmusa a biokémiai és stresszbiológiai kísérleteknek, mivel fotoszintetikus apparátusa hasonló a hajtásos növényekéhez, szaporodása ugyanakkor gyors. A vele végzett kísérletek emiatt nagy számban és ismétlésben végezhetők el, jól reprodukálhatók és ellenőrizhetőek. A Cr(VI) hatása a Chorella pyrenoidosa szaporodására A Cr(III) nem okozott lényeges változást egyik vizsgált növekedési paraméterben sem. A Cr(VI) hatására azonban minden vizsgált paraméter esetében jelentős változás következett be. Az EC50 érték 2 mg dm-3-nek adódott, ami fotoszintetizáló szervezetek esetében magas értéknek számít.

Mikroelem összetétel, króm akkumuláció A mérések során 21 elem mennyiségét határoztuk meg a teljes sejtben. Vizsgálataink arra utalnak, hogy a növekvő Cr(VI) kezeléssel párhuzamosan a Na, P, Fe, és Mg mennyisége csökken, a Ca és Cr mennyisége növekszik, míg a S esetében 5 mg dm-3 Cr(VI) koncentrációig növekedést, ettől magasabb kezelési koncentrációk esetében csökkenést tapasztalunk. A vizsgált elemek mindegyike elsősorban a sejtfal frakcióban lokalizálódott, míg a membrán és oldható frakciók között a megoszlás azonos nagyságrendű volt. Fotoszintetikus pigmentek és a szabad aminosavak mennyiségének változása A klorofillok mennyisége csökkenést mutat az emelkedő koncentrációjú Cr(VI) kezelést követően. Az α-karotin mennyisége csökken, a β-karotin mennyisége nő, a Cr(VI) stressz következményeként a β/α-karotin arány a duplájára emelkedik. Az összes szabad aminosav mennyisége 5 mg dm-3 Cr(VI) kezelési koncentrációig növekszik, ezután csökkenő tendenciát mutat. A stresszfiziológiai szempontból fontos prolin mennyisége 5 mg dm-3 koncentrációig növekszik a 72 órás kezelés alatt, hasonlóan az összes szabad aminosav mennyiségéhez. Oxidatív stressz kivédésében fontos szerepet játszó oxidoreduktázok aktivitásának változása A guajakol peroxidáz esetében az előzetes kísérleteink alapján a kezelés koncentrációjának és időtartamának előrehaladásával az enzimaktivitás növekszik, magasabb koncentrációknál már az első nap végén eléri a maximumot, majd onnan csökkenést mutat. Az aszkorbinsav peroxidáz aktivitása 0,1 mg dm-3 Cr(VI) koncentrációnál nem mutatott eltérést a kontrollhoz képest, a többi kezelénél az enzimaktivitások már az első nap végére elérték maximumukat, majd csökkenni kezdenek. A kataláz aktivitásában beálló változások némileg eltérő képet mutatnak. Az alacsonyabb és a legmagasabb koncentrációk esetében az enzim aktivitása csökkent, 1-10 mg dm-3 koncentrációk esetében pedig növekedett. Fitokelatin szintáz aktivitásának változásai A vizsgálatok során először mi mutattunk ki fitokelatin szintáz aktivitást fotoszintetizáló szervezetben Cr(VI) kezelés hatására. Az enzim aktivitása már a legalacsonyabb koncentrációban is megemelkedett, aktivitásának maximumát az első nap végére érte el, ezután csökkenő tendenciát tapasztalhattunk. Fotoszintetikus aktivitásban beálló változások Alacsony (1 mg dm-3) koncentrációjú Cr(VI) kezelések esetében nem volt lényeges eltérés a minták F0 és Fm értékei között, magasabb koncentrációk irányában az F0 értéke emelkedik. Ez a hatás a sejtek PS II pigmenttartalmának csökkenésével hozható kapcsolatba. Ezzel ellentétes irányban változnak meg a kezelt sejtek Fm értékei, melyek a magasabb koncentrációjú minták esetében csökkennek. Ezek a változások a PS II és a tilakoidstruktúra megváltozására utalhatnak. Az Fv/Fm értéke növekvő kezelési koncentrációval folyamatosan csökken. Az Fm/F0 értékekben beállt változások is a fotoszintézis hatékonyságának csökkenését mutatják. A fejlődött oxigén mennyisége csökken az idő és a Cr(VI) koncentráció függvényében. Fenil-p-benzokinon jelenlétében - ami a PS II mesterséges elektronakceptora - a csökkenés lassabban következik be, ami arra utal, hogy a fotoszintézis elsődlegesen a PS II mögött gátolt. Szénhidrát anyagcsere A keményítő mennyisége csökken a növekvő Cr(VI) koncentrációval, a mono- és diszaharidok esetében a csökkenés csak a magasabb koncentrációknál következik be. A glikolítikus irányú folyamatok katalíziséért felelős PFK és PFP enzimek aktivitásában nem tapasztaltunk jelentős változást, míg a glikoneogenetikus folyamatot katalizáló FBP-áz aktivitása csökken. Összegzésként Megállapíthatjuk, a Chlorella pyrenoidosa képes felvenni a Cr(VI)-ot és akkumulálni, bár a növekedési paramétereket csökkenti. Ugyan a Chlorella sejtek nem tekinthetők króm hiperakkumulátornak, vizsgáljuk, hogy milyen szerepet játszhatnának nehézfémek által szennyezett vizek fitoremediációjában. Mintegy 10 mg dm-3 koncentrációig a sejtek hatékonyan alkalmazzák a nehézfém stresszekkel szemben védő mechanizmusokat, valamint képesek megkötni a krómot. Ettől magasabb koncentrációk azonban a sejtanyagcsere összeomlásához vezetnek.

Effects of chromium on some metabolic processes of Chlorella pyrenoidosa In our environment, living organisms are exposed to various constrains, which limit their activity, development processes and other possibilities. These constrains are resulted partly from abiotic and biotic factors and partly from antropogenous sources such as heavy metal contamination. The aforementioned effects are known as stressors. In living organisms, stressors produce short-term and long-term responses which promote acclimation and acclimatization as well as adaptation and resistance. Acclimation and acclimatization ensure the survival for the individuals, while adaptation is a permanent capability of resistance, which develops for generations and leads to the evolvement of resistance. Different stressors may induce stress responses, which can be very specific or general as well. Considering the relatively long lifetime of a plant generation and the fixed life form of most plant species, role of acclimation seems to be remarkably important. Soluble heavy metal ions and their complex compounds with various inorganic components cause serious problems through the contamination of both the soil and the surface and subsurface waters. Macro- and micro-ecological analyses of industrial heavy metal contaminants have been carried out particularly, however, their effects at physiological/biochemical and molecular levels are not widely known. In waters, contaminating agents primarily influence the life processes of algae and other microorganisms, while mostly the environmental damages can be well detected in case of more complicated organisms. In photosynthesizing organisms, heavy metals may result in characteristic modifications in physiological and biochemical processes (plasma membrane damages, formation of oxygen radicals, appearance of free metal ions in cytosol, disorders of nutrient uptake, water balance and photosynthesis, limited growth, reduced production of flowers and seeds), which appear as a direct and/or indirect consequences of presence of contaminants. As chromium is a toxic heavy metal, which often gets to the environment in large quantities, the aim of our researches was to determine its effects on certain metabolic processes of a well known species of green algae (Chlorella pyrenoidosa). Chromium was selected for analysis because molecular mechanisms of its effects on living organisms are not widely known, however these mechanisms are under investigation presently as well. Use of algae provides new opportunities to reveal the processes of indication, accumulation, and elimination. Various species of algae are often able to accumulate large amount of heavy metals. In algae, the uptake and fixation of these heavy metals usually lead to redox processes, which transform a given heavy metal ion into a less soluble form. Additionally, this form of heavy metal is less effective for living organisms. Indirectly, our study examines the possibilities of using of green algae in the restoration of a heavy metal contaminated wetland. During our studies, we examined the effects of Cr (VI) on the reproduction of Chlorella pyrenoidosa green algae species. Furthermore, alteration of main metabolic processes characterizing the heavy metal stress were also investigated.

• How does Cr(VI) influence the reproduction, growth and biomass changes of Chlorella pyrenoidosa green algae species?
• Are green algal cells able to accumulate chromium? What distribution of chromium can be observed within a cell? What are the tendencies of changes in the micro-element composition of cells under the influence of Cr(VI) treatments?
• What changes can be observed in the composition and pattern of photosynthetic pigments and total amino acid content (with especial regard to stress-physiologically important prolin) of cells under the influence of Cr (VI) treatments?
• What changes occur in the extent of photosynthetic effectiveness? Are these modifications caused by direct or indirect effects? What changes occur in carbohydrate metabolism? What are the metabolic and enzymatic consequences?
• What changes can be observed in the activities of oxidoreductases (catalase, peroxidases), which control the prospective oxidative stress after heavy metal treatments?
• Under the influence of Cr(VI) treatment, can we find special heavy metal binding proteins (phytochelatins) or can we experience the induction of enzymes which are necessary to their synthesis? The dissertation examines the effects of toxic heavy metal ions Cr(VI) and Cr(III) on certain metabolic processes of Chlorella pyrenoidosa green algae species. Since its photosynthetic apparatus is similar to that of vascular plants, Chlorella pyrenoidosa is a popular and common test organism of biochemical and stress-biological experiments; however it can be described by a rapid reproduction. Consequently, it allows to perform a large number of tests and repetitions. These test are easy to reproduce and control. Effects of Cr(VI) on the reproduction of Chlorella pyrenoidosa Cr(III) treatment did not result in important changes in neither parameters, while in case of Cr(VI) treatments, there was significant modifications in all parameters. Value of EC50 was 2 mg dm-3, which is considered to be high in case of photosynthetic organisms. The composition of micro-elements and the accumulation of chromium Our measurements determined the amounts of 21 elements in the whole cell. The results suggest that increasing of Cr(VI) treatment lead to the decrease of Na, P, Fe and Mg concentrations and the increase of Ca and Cr content. Less than 5 mg dm-3 Cr(VI) concentrations resulted increasing S content, while higher Cr(VI) concentrations caused decreasing S content. All of the examined elements were localized primarily in cell wall, while distribution was the same between the membrane and the soluble fractions.Changes in the amounts of photosynthetic pigments and free amino acids Increasing concentrations of Cr(VI) treatments lead to decreasing chlorophyll content. Amount of α-carotin decreases, while β-carotin content increases. As a consequence of Cr(VI)-stress, rate of β/α-carotin doubles. Less than 5 mg dm-3 Cr(VI) concentrations lead to increasing amounts of total free amino acids, which show decreasing tendency when Cr(VI) concentrations exceed 5 mg dm-3 . During 72 hours-long treatments, amount of stress-physiologically important prolin increases to 5 mg dm-3 Cr(VI) concentrations, similarly to the total amount of free amino acids. Changing activities of oxidoreductases as important factors of the protection against oxidative stress On the basis of our preliminary examinations with guajakol peroxidase, increasing concentrations and periods of treatment lead to increasing enzyme activities. In case of higher concentrations, enzyme activity reaches its maximum for the end of the first day, while later it decreases. In case of 0.1 mg dm-3 Cr(VI) concentrations, ascorbic acid peroxidase activity did not differ from the control. In case of the other samples, enzyme activities reached their maximum for the end of the first day, and later they began to decrease. Activity of catalase shows slightly different alterations. The lower and the highest concentrations decreased this enzyme activity, while 1-10 mg dm-3 concentration increased it. Alterations in the activity of phytochelatine synthase Phytochelatine synthase activity in photosynthetic organism under the influence of Cr(VI) was firstly proved by our measurements. The lowest concentrations were enough to increase the enzyme activity, which reached its maximum for the end of the day and then it showed declining tendency. Changes in the photosynthetic activity In case of low (1 mg dm-3) Cr(VI) concentrations, F0 and Fm values of samples did not show significant differences, but increasing concentrations led to increasing F0 values. This can be explained by the declining amount of PS II pigments in cells. Oppositely, Fm values of treated cells decreased with the increasing concentrations. These changes may suggest the modifications of PSII and the thylacoid structure. Fv/Fm values decreases as treatment concentrations increases. Changes of Fm/ F0 values also point to the declining photosynthetic effectiveness. Amount of developed oxygen decreases as a function of time and Cr(VI) concentration. In the presence of PpBQ, which is an artificial electron acceptor of PSII, this declining process is slower suggesting that photosynthesis is primarily limited behind the PS II. Carbohydrate metabolism Increasing Cr(VI) concentrations lead to decreasing amount of starch. Decreasing concentrations of mono- and disaccharides were find only at higher Cr(VI) concentrations. We did not find significant differences in the activities of PFK and PFP enzymes, which are responsible for the glycolytic processes, while decreasing activity was measured by FBP-ase, which catalyses the glyconeogenetic process. In conclusion, we can establish that Chlorella pyrenoidosa is able to uptake and accumulate the Cr(VI), however it changes growth parameters. In spite of the fact that Chlorella cells can not be regarded as hyperaccumulators, we examine their possible role in the phytoremediation of heavy metal contaminated waters. Cells have a protecting mechanism against heavy metal stress, which is effective only when concentration is below 10 mg dm-3. Additionally, cells are also able to fix the chromium, but higher concentrations lead to the collapse of cell metabolism.