A bejuttatott DNS stabilitása a génterápiák sikerességének alapját képezi. A cytotoxikus/apoptótikus endonukleázok arról ismeretesek, hogy megemésztik az “idegen DNS/RNS-t”. Azonban, hogy melyek ezek az endonukleázok és ezen enzimek inaktiválásával növelhető-e a génbevitel sikeressége korábban nem képezte vizsgálat tárgyát. Kutatásaink során a vesében lévő két legjelentősebb proapoptótikus endonukleázt, a deoxyribonukleáz I-et (DNáz I) és az endonukleáz G-t (EndoG) vizsgáltuk. Vizsgálataink alkalmával immortalizált vese tubuláris epitél sejteket (TKPTS), valamint DNáz I és EndoG knockout (KO) egerekből izolált primer vese tubuláris epitél sejteket (PTE) használtunk. Megfigyeltük, hogy a teljes endonukleáz aktivitás szignifikánsan magasabb primer PTE sejtekben, mint immortalizált TKPTS sejtben. A sejtekben lévő endonukleáz aktivitás meghaladja a sejtek által kiválasztott, médiumban megjelenő endonukleáz aktivitást. A Lipofektaminról bebizonyosodott, hogy növeli a transzfekciók hatékonyságát, de nem védi a plazmid DNS-t az endonukleázok lebontásától. A DNáz I és az EndoG deficiens egerekből izolált primer vese sejteknek szignifikánsan magasabb a transzfekciós rátája a vad típusú (WT) sejtekénél. Továbbá EndoG KO sejtekben a fluorescens siRNS transzfekció magasabb, mint a WT sejtekben. Annak eldöntésére, hogy a DNS stabilitás növelhető-e génbevitel során specifikus inhibitorokkal gátoltuk az endonukleázok működését. Az extracelluláris DNáz I gátlása G-aktinnal nincs hátassal a DNS transzfekció hatékonyságára jelezve, hogy az intracelluláris DNáz I az elsődleges molekuláris szereplője az idegen DNS-elleni gazdasejt védelemnek. Eredményeink tükrözik a DNáz I és EndoG sejtvédekezésben betöltött szerepét a génbejuttatás szempontjából primer tubuláris epitél sejtek esetén.

Gene delivery to kidney cells is essential for the development of gene therapy of nephropathy. Maintaining DNA stability is crucial for successful gene delivery. Endonucleases are known to play a role in degrading “foreign” DNA imported to the cell. However, what these DNases are and whether inactivation of these enzymes can improve gene delivery has not been examined. We have recently shown that two proapoptotic endonucleases, deoxyribonuclease I (DNase I) and endonuclease G (EndoG) are responsible for more than 90% of the total endonuclease activity in mouse kidney. Since primary cells are notoriously resistant to transfections, we studied DNA stability during gene delivery to primary renal tubular epithelial cells isolated from mice. We found that as compared to immortalized mouse tubular epithelial (TKPTS) cells, primary cells had higher total endonuclease activity. Endonuclease activity was present both in total cellular protein extracts (DNase I, EndoG and other DNases) and in culture media (mainly DNase I). Pre-treatment with Lipofectamine did not protect plasmid DNA against in vitro digestion by endonucleases. DNase I- or EndoG-deficient primary tubular epithelial cells isolated from knockout mice showed significantly higher rate of transfection by Lipofectamine-packed pECFP-N1 plasmid DNA than wild-type cells. We examined whether specific inhibition of these endonucleases may improve DNA stability during gene delivery. The transfection efficiency was increased by apoptosis inhibitors. Complete inhibition of extracellular (secreted) DNase I by G-actin did not improve plasmid transfection, which indicates that only intracellular DNase I is important for DNA stability. These data demonstrate the important role of the cytotoxic endonucleases in host cell defense against gene delivery in primary tubular epithelial cells.