Retrovirális proteinázok és kaszpázok specifitásának vizsgálata molekuláris biológiai, enzimológiai és molekuláris modellezési módszerekkel

A tétel rövid nézete
dc.contributor.advisorTőzsér, József
dc.contributor.authorZahuczky, Gábor József
dc.contributor.departmentDE -- Orvos- és Egészségtudományi Centrum -- Általános Orvostudományi Kar -- Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézethu
dc.contributor.departmentElméleti orvostudományok doktori iskolahu
dc.date.accessioned2007-06-21T13:35:29Z
dc.date.available2007-06-21T13:35:29Z
dc.date.defended2003-09-29
dc.date.issued2003
dc.description.abstractA doktori értekezésemben felhasznált munkáim során alkalmam volt a retrovirális proteinázok HTLV-BLV csoportjába tartozó proteinázok fő képviselőinek (HTLV-I, BLV PR) előállítására, specificitásuknak egymással, illetve a HTLV-I PR specificitásának a HIV-1 PR-al történő összehasonlítására. Lehetőségem volt még a ciszteinil proteinázok egyik élettani szempontból igen fontos szereppel bíró családjának, a kaszpázoknak három képviselőjével kísérleteket végezni a szubsztrát-foszforiláció és a hasíthatóság összefüggéseinek a vizsgálatára, valamint mutáns kaszpáz-3 enzimek előállítására. Vizsgálataink a két enzimcsalád enzim-szubsztrát kölcsönhatásainak alapos megismerését szolgálták, miközben általános összefüggések felismerésére törekedtünk. BLV PR előállítása érdekében a proteináz cDNS-t fúziós vektorba (pMal-c2) klónoztuk, amelyből expresszáltattuk és tisztítottuk. A tisztítás során kiderült, hogy az enzim képes saját aktív formájának a kialakítására, az előállítását szolgáló konstrukcióból önmaga kihasítására, mind N- és C-terminális irányból. Sikerült az enzimet inklúziós testekből kinyernünk, majd kationcserés és gélszűréses módszerrel homogénre tisztítanunk. Tárolás során további részleges önprocesszálást tapasztaltunk, ami azonban nem járt szignifikáns aktivitáscsökkenéssel. A HTLV-I és BLV proteinázok specificitás-összehasonlítása alapján arra következtethetünk, hogy a BLV PR szélesebb specificitással rendelkezik mint a HTLV-I PR, de a specificitásbeli különbség közöttük – a szubsztrátkötő régiót alkotó részben található homológiával arányosan - nagyobb, mint ami a HIV-1 és HIV-2 PR között tapasztalható. A HTLV-I proteinázok specificitásvizsgálatait a már számos egyéb retrovíruscsalád reprezentatív képviselőjének jellemzésére is felhasznált HIV-1 MA/CA peptidsorozattal kívántuk elvégezni, de a vizsgálatok során kiderült, hogy a HTLV-BLV csoport képviselőinek a többi retrovirális proteinázétól való eltérő szubsztrátspecificitása miatt más sorozatot kell választanunk. A HTLV-I és a HIV-1 proteinázok közötti különbségek részleteit az alzsebek vonatkozásaiban a HTLV-I CA/NC peptidsorozattal tártuk fel. A vizsgálataink azt mutatták, hogy a HIV-1 proteinázoktól eltérően az S4 és S2 zsebek esetében döntően a hidrofób jellegű kölcsönhatások a meghatározóak, míg az S3, S1 és S1’ zsebek specificitásában nagyobb a hasonlóság. A HIV-1 MA/CA hasítási helyhez hasonlóan úgy tűnik, hogy a HTLV-I CA/NC hasítási hely is evolúciósan az újonnan szintetizálódó poliproteinek gyors hasítására szelektálódott ki, mivel a szubsztituált szubsztrátok nagy része lényegesen lassabban hasadt mint a szubsztituálatlan analógok. A kaszpáz specificitásvizsgálatainkat konkrét kérdéskörre szűkítettük, mivel az általános specificitásvizsgálatokat már korábban elkészítették. Ez a kérdéskör a foszforiláció volt, amely egy teljesen általános szabályozási mechanizmus. A foszforiláció proteolízisre kifejtett hatásának tanulmányozása a foszforilált aminosavak közvetlen szerepének feltárásával ritka az irodalomban. Számos esetben a foszfo-Ser mimikálása érdekében helyspecifikus mutagenezissel lecserélik a Ser oldalláncot aszpartátra és így próbálnak meg funkcionális következtetéseket levonni. Vizsgálataink bebizonyították, hogy legalábbis a kaszpázspecificitás tekintetében az Asp és a foszfo-Ser semmiképpen sem tekinthető ekvivalensnek: míg a kaszpáz-3, -7, -8 enzimek számára az Asp eszenciális a P1 pozícióban, és a P4 pozícióban is erősen preferált a kaszpáz-3 és -7 enzimek számára, a foszfo-Ser ugyanezen poziciókban erősen csökkentette vagy teljesen meggátolta a hasíthatóságot. Ebből adódóan a P1’ és P4 Ser oldalláncok foszforilációjának szabályozó szerepe lehet a fehérjék kaszpáz mediált lebontásában.en
dc.description.degreeEgyetemi Doktori (Ph.D.) Értekezés ; Debreceni Egyetem, Orvos- és Egészségtudományi Centrum, Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet, 2003hu
dc.description.degreePhDhu_HU
dc.format.extent52 pen
dc.format.extent450079 bytes
dc.format.extent384601 bytes
dc.format.extent1981689 bytes
dc.format.mimetypeapplication/pdf
dc.format.mimetypeapplication/pdf
dc.format.mimetypeapplication/pdf
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/2437/2464
dc.languagehunhu
dc.language.isohuen
dc.language.isoenen
dc.rightsA kéziratos PhD dolgozatok csak a szerzői jogok maradéktalan tiszteletben tartásával használhatókhu
dc.subject.disciplineElméleti orvostudományokhu
dc.subject.sciencefieldOrvostudományokhu
dc.titleRetrovirális proteinázok és kaszpázok specifitásának vizsgálata molekuláris biológiai, enzimológiai és molekuláris modellezési módszerekkelen
dc.title.subtitleegyetemi doktori (Ph.D.) értekezésen
dc.title.translatedStudies on the Substrate Specificity of Retroviral Proteinases and Caspases with the Methods of Enzimology, Molecular Biology and Molecular Modellingen
dc.typePhD, doktori értekezéshu
Fájlok
Eredeti köteg (ORIGINAL bundle)
Megjelenítve 1 - 3 (Összesen 3)
Bélyegkép
Név:
Zahuczky_Gabor_ertekezes.pdf
Méret:
1.89 MB
Formátum:
Adobe Portable Document Format
Letöltés
Bélyegkép
Név:
Zahuczky_Gabor_tezis_angol.pdf
Méret:
375.59 KB
Formátum:
Adobe Portable Document Format
Letöltés
Bélyegkép
Név:
Zahuczky_Gabor_tezis_magyar.pdf
Méret:
439.53 KB
Formátum:
Adobe Portable Document Format
Letöltés
Gyűjtemények
Molekuláris Orvostudomány Doktori Iskola