Az utóbbi évtizedben a tudomány gyors fejlődése megteremtette a lehetőségét, hogy a kutatók in vitro és in vivo kísérletek nélkül számítógép segítségével (in silico) gátlószereket tervezzenek. J. M. Hayes és munkatársai ilyen számítógépes szűrést végeztek, hogy lehetséges aktív centrumon keresztül gátolni képes glikogén foszforiláz inhibitor molekulákat azonosítsanak. A vizsgált vegyületek közül a 7 legígéretesebb molekula ki lett választva, melyeket Somsák László és munkacsoportja megszintetizált. Jelen munkám egyik célja, hogy elvégezzük a kiválasztott vegyületek kinetikai méréseit, és összehasonlítsuk a számítógéppel kapott eredményeket az in vitro kísérletek során kapott eredményekkel. A vizsgálataink során megállapítottuk, hogy a mért Ki-vel rendelkező vegyületek kompetitív módon gátolják az enzim aktív centrumát. A szimuláció által legjobb gátlószernek jósolt 5c vegyület rendelkezett a legalacsonyabb mért Ki értékkel (1,97 μM), de a számítógépes számítások előrejelzéseitől elmaradt. A 13b (Ki = 4,58 μM) 12b (Ki = 26,2 μM) erőssége megfelelt a számításoknak megfelelően azonban a 13a (Ki = 68,6 μM) és a 13c (Ki = 71,1 μM) a várt értéktől elmaradt. A 12a (Ki = 326 μM) 12c (Ki = 540 μM) vegyületek sokkal gyengébb inhibitoroknak bizonyultak, mint azt a számítások után vártuk. Munkám másik részében glükóz analóg inhibitor vegyületek SGLT1 és 2 gátlóképességét vizsgáltam. A vizsgált vegyületek kiválasztásánál figyelembe vettük, hogy az orvosi gyakorlatban használt SGLT2 inhibitorok szerkezetéhez hasonló glikogén foszforiláz inhibitorok is képesek lehetnek gátolni az SGLT2 fehérjét. A vizsgálat elvégzéséhez lentivirális transzfekcióval létre hoztunk SGLT1 és SGLT2-t fehérjét overexpresszáló stabil sejtvonalakat. A transzfekció sikerességét Western blot, és 2-NBDG felvétel segítségével bizonyítottuk. Továbbá a sejtvonalakat dapagliflozin segítségével validáltuk. A tesztelt vegyületek nem mutattak citotoxicitást. A vizsgált vegyületeket 2 csoportra osztottuk, egyik csoport tagjai újonnan szintetizált vegyületek, a másik csoport korábban glikogén foszforiláz gátlásra vizsgált vegyületek. Az első csoport tagjai között néhány új SGLT-inhibitort azonosítottunk, amelyek IC50 értékei mikromol tartományban volt, de elmaradtak az ismert C-glükozil-arén típusú inhibitorok gátlóképességéhez képest. A proximális aromás csoport, oxadiazol vagy triazolra történő cseréje a gátlás 20-30-szoros gyengüléséhez vezetett (23a vs. 19a és 20a). Egy fenilgyűrű bejuttatása az 1,2,4-triazol N1-atomjára jelentős hatékonyság javulást eredményezett (23c vs. 23a), míg egy hidroxi-etilcsoport azonos helyzetbe kapcsolása a gátlás teljes elvesztését okozta (23a vs. 23b). A 22 (imidazol) a 23a-val (1,2,4-triazol) összehasonlítva, amely szintén tartalmaz NH-csoportot, ~20-szor hatékonyabbnak bizonyult. Második csoportban a tiazolt tartalmazó vegyületek nem mutattak gátló hatást. A vegyületek többsége az SGLT2-t jobban gátolta, mint az SGLT1-et, kivétel a 26b és a 29b vegyületek, melyek az SGLT1-et gátolták jobban. Továbbá a 25a – 25b és a 28a – 28b összehasonlításban, a 2-naftil-származékok erősebb gátolták az SGLT2-t, mint az SGLT1-et. A 28b vegyület, 3,5 μM SGLT2 IC50 értékével, a legjobb inhibitornak bizonyult, és figyelembe véve a GF nanomol gátlását, a 28b vegyület egy több célpontú vegyület, amely kiindulópontja lehet további antidiabetikus vizsgálatokban.

The liver plays an important role in maintaining proper blood glucose levels by regulating blood glucose levels through gluconeogenesis and glycogen synthesis/degradation. A key enzyme in glycogen degradation is glycogen phosphorylase, which catalyses the first step of degradation. The enzyme has 5 ligand binding sites through which specifically designed molecules can inhibit the activity of the enzyme. Another important organ for maintaining adequate blood glucose levels is the kidney. In the proximal tubule of the kidney, there are two types of sodium-dependent glucose cotransporters (SGLT1 and 2) responsible for glucose reabsorption. Considering the physiological functions of SGLT1 and SGLT2, they have become reasonable targets for drug discovery in the 2000s and several clinical drugs are currently in use. These SGLT2 inhibitors inhibit glucose reabsorption, thereby reducing blood glucose levels and increasing urinary excretion of glucose. Rapid advances in science over the last decade have made it possible for researchers to design inhibitors using computers without in vitro or in vivo experiments. Joseph M. Hayes and colleagues performed such computer screening to identify potential glycogen phosphorylase inhibitor molecules, which inhibit the active site of the enzyme. From the compounds screened, the 7 most promising molecules were selected and synthesized by Dr. László Somsák and his team. One of our aims of the present work was to perform kinetic measurements of the selected compounds and compare the computer-generated results with those obtained in in vitro experiments. In our studies we found that compounds with measured Ki competitively inhibit the active site of the enzyme. Compound 5c, which was predicted by simulation to be the best inhibitor, had the lowest measured Ki (1.97 μM), but fell short of the predictions of the computer calculations. The potency of compounds 13b (Ki = 4.58 μM) and 12b (Ki = 26.2 μM) corresponded to the calculations but 13a (Ki = 68.6 μM) and 13c (Ki = 71.1 μM) fell short of the predicted value. Compounds 12a (Ki = 326 μM) and 12c (Ki = 540 μM) proved to be much weaker inhibitors than expected based on the calculations. In the second part of my work, I investigated the SGLT1 and 2 inhibitory activity of glucose analogue inhibitor compounds. In the selection of the compounds tested, we took into account Sebastian Vidal's summary article, which states that glycogen phosphorylase inhibitors similar to the structure of SGLT2 inhibitors used in clinical practice may also be able to inhibit the SGLT2 protein. The general structure of the SGLT2 inhibitors already on the market includes a glycopyranose ring with a benzene ring linked by a C-glycoside bond, and an aromatic group linked to the benzene ring by a methylene bridge. My colleagues have synthesized a number of glucose analogue inhibitors with similar structures to commercially available SGLT2 inhibitors, but instead of the first aromatic ring, the molecules contain a heteroatomic ring, pyrimidine, oxadiazole, imidazole, thiazole, or triazole. To perform this study, stable cell lines, which overexpress SGLT1 and SGLT2 protein, were generated by lentiviral transfection. The success of the transfection was demonstrated by Western blot and 2-NBDG uptake. Furthermore, the cell lines were validated by dapagliflozin. The tested compounds showed no cytotoxicity. The tested compounds were divided into 2 groups, one group consisting of newly synthesized compounds and the other group of compounds previously tested for glycogen phosphorylase inhibition. Among the members of the first group, we identified some new SGLT inhibitors with IC50 values in the micromolar range, but lagging behind the inhibitory activity of known C-glucosyl-arene type inhibitors. Substitution of the proximal aromatic group, oxadiazole, for triazole led to a 20-30-fold attenuation of inhibition (23a vs. 19a and 20a). Insertion of a phenyl ring on the N1 atom of 1,2,4-triazole resulted in a significant efficiency improvement (23c vs. 23a), while switching a hydroxyethyl group to the same position caused a complete loss of inhibition (23a vs. 23b). Compared with 23a (1,2,4-triazole), which also contains an NH group, 22 (imidazole) was found to be ~20-fold more effective. In the second group, compounds containing thiazole showed no inhibitory effects. Most of the compounds inhibited SGLT2 more than SGLT1, except compounds 26b and 29b, which inhibited SGLT1 more. Furthermore, in the comparisons 25a - 25b and 28a - 28b, the 2-naphthyl derivatives, inhibited SGLT2 more strongly than SGLT1. Compound 28b, with an SGLT2 IC50 of 3.5 μM, was found to be the best inhibitor, and considering the nanomolar inhibition of GF, compound 28b is a multi-target compound that could be a starting point for further antidiabetic studies.