Doktori (PhD) értekezés tézisei

A gyulladásos környezet és a pravasztatin hatása a vázizom regenerációs képességére

Cseri Karolina

Témavezetők: Prof. Dr. Csernoch László, Dr. Tőzsérné Dr. Benkő Szilvia

DEBRECENI EGYETEM Molekuláris Orvostudomány Doktori Iskola

Debrecen, 2022.

A GYULLADÁSOS KÖRNYEZET ÉS A PRAVASZTATIN HATÁSA A VÁZIZOM REGENERÁCIÓS KÉPESSÉGÉRE

Értekezés a doktori (PhD) fokozat megszerzése érdekében az Elméleti Orvostudományok tudományágban

Írta: Cseri Karolina okleveles molekuláris biológus

Készült a Debreceni Egyetem Molekuláris Orvostudomány Doktori Iskolája (Élettan és Neurobiológia programja) keretében

Témavezető: Dr. Csernoch László, Dr. Tőzsérné Dr. Benkő Szilvia

Az értekezés bírálói: Dr. Lontay Beáta, PhD Dr. Almássy János, PhD

A bírálóbizottság: elnök: Prof. Dr. Papp Zoltán, MTA doktora tagok: Dr. Ivanics Tamás, PhD Prof. Dr. Tóth Attila, MTA doktora

Az értekezés védésének időpontja: Debreceni Egyetem ÁOK, Élettani Intézet, Könyvtár 2022. július 18., délután 14 óra

Bevezetés és irodalmi áttekintés A szívinfarktus és az ischémiás szívbetegség az 1900-as évek előtt szinte teljesen ismeretlen volt. 1920 után egyre több esetről számoltak be, s az 1930-as évekre már komoly közegészségügyi problémát okozott. A statisztikák alapján Amerikában jelenleg minden tizedik másodpercben létrejön egy szívinfarktus. Magyarországon évente 50 ezer ember hal meg szívrohamban. Napjainkban széles körben elfogadott nézet, hogy a szívhalálozás mögött a mozgásszegény életmód, a túlzott táplálékfelvétel, a finomított élelmiszerek túlfogyasztása és a rostszegény táplálkozás áll. A táplálkozás koleszterinszint növelő hatásának, valamint a magas vérzsírszint és a szívhalálozás közötti összefüggés elméletének akadnak ellenzői, de a koleszterinszintcsökkentő sztatinok népszerűsége évek óta töretlen. Kockázatuk abban rejlik, hogy a sztatinok amellett, hogy blokkolják a szervezet saját koleszterinszintézisét, egyéb olyan módokon is befolyásolják az anyagcserét, az önszabályozó mechanizmusokat, melyek jelenlegi ismereteinken még túlmutatnak. Mellékhatásként egyre gyakoribb az autoimmun izomérintettség vagy a végzetes veseelégtelenség.

Idiopátiás inflammatórikus miopátiák

Az idiopátiás inflammatórikus miopátiák (IIM) olyan neuromuszkuláris betegségek heterogén csoportjait foglalják magukban, melyeket általánosan myositisként szokás említeni. Ezeket évtizedekig három alcsoportra osztották az izomgyengeség, izomgyulladás és extramuszkuláris tünetek megléte és súlyossági foka alapján. 1975-ben Bohan és Peter munkássága nyomán még csak két csoportot tartottak számon, a polymyositist (PM) és a dermatomyositist (DM), majd 1995-ben Griggs és munkatársai leírták a zárványtestes myositist is (inclusion body myositis, IBM), mint harmadik csoportot. 2003-ban egy nemzetközi konferencián (European Neuromuscular Centre International Workshop – 2003 ENMC-IIM) immunmediált nekrotizáló miopátiával (IMNM) és nem-specifikus miozitisszel bővítették a meglévő kategóriákat. Az elmúlt évtized kutatási eredményei, a myositis-specifikus antitestek (MSA) felfedezése és a kiterjedt klinikai tapasztalatok alapján szükségessé vált egy új klasszifikációs rendszer megalkotása. A diagnózis felállításakor először az EULAR/ACR (European League Against Rheumatism/American College of Rheumatology) klasszifikációs kritériumokat kell figyelembe venni, majd egy többlépcsős szempontrendszer alapján lehet meghatározni az alcsoportot. A jelenlegi kategorizálás hat alcsoportot különít el: polymyositis (PM)- melynek alcsoportja lett az immunmediált nekrotizáló miopátia (IMNM), zárványtestes myositis (IBM), amiopátiás dermatomyositis (ADM), dermatomyositis (DM), és fiatalkori dermatomyositis (juvenilis dermatomyositis, JDM). Amennyiben a páciens tünetei megfelelnek az EULAR/ACR IIM-re felállított kritériumrendszerének, a következő szempont a páciens életkora az első tünetek megjelenésekor. Amennyiben 18 éves kor alatt jelentkeztek a panaszok, úgy a bőrtünetek megléte esetén juvenilis dermatomyositis, bőrtünetek hiányában juvenilis myositis lehet a diagnózis. 18 éves kor fölött felnőttkori megbetegedésről beszélhetünk, ebben az esetben a következő szempont a bőrtünetek megléte vagy hiánya. Amennyiben bőrtünet nincs, de terápiára nem reagáló ujjhajlítóizom gyengeséget panaszol a páciens vagy az izombiopsziás mintán igazolódott a rimmed vakuóla, akkor a diagnózis zárványtestes myositis, amennyiben sem az ujjhajlító izom makacs gyengesége nem jellemző, s a szövettani képen sem igazolódott rimmed vakuóla jelenléte, úgy a diagnózis polymyositis. Abban az esetben, ha felnőttkori kezdetnél bőrtünetek is jelentkeznek, eldöntendő kérdés, hogy jellemző-e a felső vagy az alsó végtagok szimmetrikus és progresszív gyengesége, vagy a nyakhajlító izmok gyengülése a nyakfeszítőkhöz képest, vagy az alsó végtagok proximális gyengesége a disztális régiókhoz képest. Amennyiben ezek közül legalább egy tünet jelen van, úgy a diagnózis dermatomyositis, ha nincs, akkor amiopátiás dermatomyositis állhat fenn.

A koleszterin

A koleszterin a lipidek közé tartozó, szteránvázas, szerves molekula. Nélkülözhetetlen alkotó eleme az emberi és állati sejtek membránjának. A koleszterin prekurzorként szolgál az epesavak, szteroid hormonok és a D-vitamin bioszintéziséhez. A szervezet minden egyes sejtje képes szintetizálni, gerincesekben legnagyobb mennyiségben a májsejtek termelik. Már száz évvel ezelőtt megfigyelte Virchow a német patológus, hogy a miokardiális infarktusban elhunyt páciensek artériáinak fala vastag és szabálytalan, illetve sárgás, zsíros anyaggal tömített. Az artériának ezt a patológiás megjelenését aterómának nevezte el. A kutatók kezdetben szkeptikusan álltak a koleszterin és a szívkoszorúér betegségek kapcsolatához, de később egyre több tanulmány látott napvilágot, melyek bizonyították a koleszterin szerepét a szív- és érrendszeri betegségek kialakulásában. Későbbi vizsgálatokban kimutatták, hogy a koronária betegségekből eredő halálozás főleg az alacsony denzitású lipoprotein (LDL) koleszterinnek tulajdonítható, mely a totál koleszterin 70%-át teszi ki. Így született meg az az elmélet, mely szerint a megemelkedett totál, pontosabban LDL koleszterinszint okozhat koszorúér megbetegedést. Jelenleg a fejlett országokban és hazánkban is emberek millióinak halálát okozzák az érelmeszesedés talaján kialakult szív-és érrendszeri betegségek, melyek nem csak korai halálozással, hanem hosszú, rokkantságban telt évekkel is sújtják a társadalmat.   A sztatinok

A sztatinok széles körben alkalmazott, nagy hatékonyságú gyógyszerek a hiperkoleszterinémia kezelésében. A koleszterinszint csökkentése mellett enyhítik a gyulladást és az oxidatív stresszt. A sztatinok a 3-hidroxi-3-metilglutaril-koenzim A (HMG-CoA-) reduktáz kompetitív gátlószerei. A koleszterin szintézis során a HMG-CoA reduktáz katalizálja a HMG-CoA átalakulását mevalonáttá. A sztatinokat a máj metabolizálja, így elsődleges hatásukat a májban fejtik ki. A HMG-CoA reduktáz gátlásával a májban és egyéb szövetekben csökken a koleszterinszintézis, s mivel a koleszterin nagyon fontos alkotó eleme a sejtmembránoknak, a sejtek a plazma lipoproteinjeinek felvételével próbálják a hiányt fedezni, ehhez pedig fokozzák az LDL receptoraik szintézisét. A sztatinok ilyen közvetett módon képesek csökkenteni a plazma koleszterinkoncentrációját, dózistól függően akár 55%-kal is. A sztatin terápia során néhány esetben súlyos mellékhatásokkal lehet számolni, melyek a vázizmokat károsítják. Izomkárosító hatásuk szorosan összefügg magas plazmakoncentrációjukkal. A vázizmot intenzív anyagcsere és magas vérátáramlás jellemzi , így számos anyagot nagy mennyiségben képes megkötni, ennek következtében erősen ki van téve a vérben keringő gyógyszerek hatásainak. A sztatinok által kiváltott izomkárosodások kialakulásuk szerint lehetnek toxikus, nem-autoimmun eredetű miopátiák és sztatin-indukált nekrotizáló autoimmun miopátiák (SINAM). A tünetek súlyossága dózisfüggő. A sztatin-indukált miotoxicitás tünetei viszonylag széles spektrumon mozognak, az enyhe nem specifikus mialgiáktól kezdve az emelkedett kreatin kináz szintekkel járó myositisen át egészen az életveszélyes rabdomyositisig, melynek végső stádiuma a veseelégtelenség. A toxikus miopátia a sztatin kezelés megvonásával legtöbb esetben megszüntethető. A sztatinokhoz köthető autoimmun betegségek közé tartozik a tipikus polymyositis és dermatomyositis.

High mobility group box 1 protein (HMGB1)

Az érett korú páciensek esetében az izompanaszok megjelenését a koleszterinszint csökkentését célzó sztatin terápia iniciálja. Egyes esetekben a kezelés felfüggesztése sem oldja meg a panaszokat, mivel a tüneteket autoimmun folyamatok állandósítják. A károsodott sejtekből kiszabadult molekulák, mint a HMGB1, a továbbiakban is triggerelik a gyulladást. Így a HMGB1-nek patogén szerepe lehet az izomgyulladás, izomgyengeség, izomfájdalom kialakulásában, olyan autoimmun betegségeknél, mint az idiopátiás inflammatórikus miopátiák, vagy a reumatoid artritisz. A „High Mobility Group” fehérjék nem-hiszton típusú kromatinfehérjék, melyek minden sejttípusban jelen vannak. Az élő sejtekből aktívan, az elpusztult sejtekből passzívan szabadul föl. Az extracelluláris térben alarmin, azaz figyelmeztető funkciót ellátva képes aktiválni a természetes (veleszületett) immunrendszert. Az extracelluláris térbe nagy mennyiségben kijutott HMGB1-nek gyulladáskeltő hatása van. A HMGB1 két, pozitív töltésű DNS kötő alegységből (A és B box) és egy negatív töltésű savas végződésből áll. Két nukleáris lokalizációs szignál szakaszt tartalmaz (NLS1: 28-44 aminosavak; NLS2: 179-185 aminosavak), melyek fontos szerepet töltenek be a fehérje sejtmagba történő transzportjában. A RAGE kötéséért az 50-183 közötti aminosav szakasz felelős. Az extracelluláris citokin aktivitás a B boxban található, és a hasított A box alegység segítségével antagonizálható. A B box 106-os pozícióban található ciszteinje nélkülözhetetlen ahhoz, hogy a HMGB1 aktiválni tudja a citokin felszabadulást. A fehérje transzkripciót stimuláló hatását a C-terminális savas vég biztosítja. Jelenleg ismert, bizonyított receptorai a toll-szerű receptor-4 (TLR-4) és a RAGE (receptor for advanced glycation end products). Számos receptor rendszert kapcsolatba hoztak a HMGB1-gyel de ezek feltételezhetően nem a valódi receptorai, hanem a HMGB1-gyel komplexbe kerülő molekulákra specifikusak. A HMGB1 és RAGE közötti kapcsolat hatása jelenleg intenzív kutatás tárgyát képezi. A vizsgálatok összességében arra mutatnak, hogy a HMGB1 kötődése RAGE-hez közvetlenül aktiválja az NF-κB útvonalat és az ebből fakadó citokin képződést. A makrofágokon mind a TLR-4 mind pedig a RAGE receptor megtalálható, de ha a TLR-4 funkcionálisan inaktív, vagy nincs jelen, akkor a sejtet a HMGB1 egyik izoformája sem tudja citokintermelésre ösztönözni. Így feltételezhető, hogy a HMGB1-RAGE kapcsolat közvetlenül nem képes citokintermelést indukálni.   Célkitűzések

Humán biopsziás és műtéti anyagokon végzett kísérleteink során az alábbi kérdésre kerestünk választ:

-Hogyan hat az in vivo gyulladásos környezet az izom szatellita sejtjeinek proliferációs és differenciációs képességére?

Egyes IIM-ben szenvedő páciensek a biopsziavételezés idején már kortikoszteroid kezelés alatt álltak, mely további kérdéseket vetett fel:

-Milyen hatása lehet az in vivo metilprednizolon kezelésnek a miogenezisre? -Hogyan befolyásolja a kortikoszteroid kezelés a miozitiszes izomból indított primer tenyészetek osztódó és fúzionáló képességét?

A klinikumban jól ismert jelenség, hogy egyes pácienseknél a sztatin kezelés autoimmun folyamatokat beindítva krónikus miopátiát okoz. Ez több kérdést is felvetett:

-Sztatin indukálta miopátiás izomban a makrofágok és a miogén sejtek hogyan hatnak egymás proliferációjára? -A pravasztatin, mint ismert gyulladáscsökkentő anyag, képes-e mérsékelni az izomgyulladást?

• Hogyan hat a pravasztatin a miogén sejtek proliferációs és differenciációs képességére?

Az izomgyulladás in vitro modellezésére C2C12 izomsejtekből és RAW264.7 makrofágokból álló kokultúrákat hoztunk létre, melyeken tanulmányoztuk a sejtek osztódási rátáját és IL-6 termelését, az izomsejtek fúziós kapacitását, valamint a pravasztatin kezelésre történő változásokat. Hipotézisünk az volt, hogy a gyulladásos környezet a szatellita sejteket a regenerációs folyamatok beindítására serkenti. Emellett azt is feltételeztük, hogy a gyulladást mérséklő szteroid kezelés rontja az izomregeneráció esélyeit. A pravasztatintól pedig gyulladáscsökkentő hatást vártunk.   Anyagok és módszerek

Humán eredetű harántcsíkolt izomszöveten végzett kísérletek, vizsgálatok

Humán eredetű harántcsíkolt izomszövet felhasználásának etikai jóváhagyása

A vizsgálati protokollt a Debreceni Egyetem Orvos- és Egészségtudományi Centrum Humán Etikai Bizottsága hagyta jóvá. Minden páciens írásbeli és szóbeli tájékoztatást kapott a vizsgálat menetéről, és írásban beleegyező nyilatkozatot tett arról, hogy szövetmintáját kísérleteinkhez felhasználhatjuk.

Biopsziás minták és műtéti anyagok beszerzése

Kísérleteinkhez használt humán izom minták egy része polymyositisben (n=15) és dermatomyositisben (n=6) szenvedő páciensek izombiopsziás anyaga, másik része oszteoartritiszes betegek (n=12) ortopédiai műtét során felszabadított vázizom darabjai. A 21 IIM páciens közül 13 a biopszia vételt megelőzően nem kapott kortikoszteroid terápiát míg 8 beteg napi 12-16 mg methylprednisolon kezelést kapott. Az IIM páciensek életkora 23 és 74 év között változott (52,7 ± 13,3; mean ± SD, n=21). Nemek szerint 3 férfi és 18 nő vett részt a vizsgálatokban. A proximális izmok biopsziavételezése sebészi úton történt helyi érzéstelenítésben (deltaizom, négyfejű combizom - attól függően, hogy az adott páciensnél melyik volt leginkább érintett). A középső farizomból származó mintákat coxartrózisban szenvedő páciensek csípőprotézis műtéte során gyűjtöttük (életkor szerint 65,3 ± 8,8, n=12, 4 férfi, 8 nő).   Humán vázizom szatellita sejtjeiből indított primer sejttenyészetek

A biopsziás és csipőprotézis műtétek során gyűjtött izomminták szatellita sejtjeit mechanikus és enzimatikus elválasztással szabadítottuk ki. A biopsziás mintát 0,75 mg/ml 2-es típusú kollagenázt valamint tripszint tartalmazó Ca2+- és Mg2+- mentes foszfát pufferben emésztettük. A kiszabadult sejteket 5% magzati szarvasmarha és 5% lószérumot (HS) tartalmazó HAM’s F12 növesztő médiumban üveg fedőlemezre szélesztettük és 37 ֯C-on 5% CO2 jelenlétében tenyésztettük. A differenciáció beindításához a tenyésztett sejteket 4 nap után 2% HS-t és 2% FBS-t tartalmazó differenciációs tápfolyadékba helyeztük a következő 7 napra.

Proliferáció és differenciáció vizsgálata humán vázizom primer sejttenyészetein

A humán vázizomsejtek primer sejtkultúráiról a kiszélesztéstől számított 2. naptól kezdve a 11. napig felvételeket készítettünk 24 óránként fáziskontraszt mikroszkóp és a hozzá kapcsolt Canon EOS-300D, digitális tükörreflexes kamera segítségével. Minden üveglemezről 5 fotó készült az egyes napokon. A fotókon manuálisan jelöltük a miogén sejtmagokat, majd morfometriai elemzést végeztünk. A proliferáció jellemzéséhez normáltuk a miogén magok számának növekedését a tenyészet 2. napján számolt magszámra. A differenciáció kifejezésére a fúziós indexet adtuk meg, mely a miotubulusokban található magok száma és az összes miogén magszám hányadosaként fejezhető ki.   Immunhisztokémia a HMGB1 kimutatására:

Az immunhisztokémiai vizsgálathoz (IHC) formalinban fixált, parafinba ágyazott izommintákat dolgoztuk fel. A HMGB1-re specifikus elsődleges antitestet (egérben termeltetett monoklonális anti-HMGB1 antitest) 1% szarvasmarha szérum albumint tartalmazó foszfát pufferben (PBS) 1:500 arányban hígítva használtuk 2µg/ml végkoncentrációban. A metszeteket a primer antitesttel egy éjszakán át inkubáltuk 4֯C-on, nedves kamrában és másnap háromszor mostuk 10 percig PBS-ben. A mosási lépéseket követően torma peroxidázzal konjugált, egér ellen termeltetett másodlagos antitesttel 15 percig inkubáltunk szobahőmérsékleten. A reakciót VECTOR DAB peroxidáz szubsztrát kit segítségével tettük a gyártó által javasolt protokollt követve. A sejtmagok kontrasztfestése hematoxilinnal történt. A szövettani festéshez humán mandulából készült metszetek szolgáltak pozitív kontrollként. A negatív kontrollhoz primer antitestet nem tartalmazó, 1%-os borjú szérum albumin (BSA) oldattal inkubáltuk a metszeteket

Immunhisztokémia CD45 kimutatására

Formalinban fixált, parafinba ágyazott humán izomból készült metszeteken mutattuk ki a CD45 pozitív sejtek jelenlétét. A parafinos metszeteket előbb deparafináltuk, rehidráltuk, majd az endogén peroxidázok hatásának kiküszöbölésére desztillált vízzel készített 0,3%-os H2O2 oldattal inkubáltuk 15 percig nedves kamrában, szobahőmérsékleten. Az antigének feltárása Tris-EDTA oldattal (10 mM Tris bázis, 1 mM EDTA oldat, 0.05 % Tween 20, pH 9.0) történt hagyományos konyhai főzőkuktában (100 ֯C), a forrástól számítva 20 percig. A nem specifikus kötőhelyeket 5% BSA-PBS oldattal blokkoltuk. A szövetmetszeteket 1 órán át inkubáltuk egérben termelt monoklonális, humán CD45 elleni antitesttel, melyet 2,5% BSA-PBS-ben 1:50 arányban hígítottunk. Negatív kontrollhoz primer antitest nélkül készült 2,5% BSA-PBS-ben inkubáltuk a metszeteket. A másodlagos antitest peroxidáz polimerrel konjugált, kecskében termeltetett nyúl elleni antitest. A reakciót VECTOR VIP peroxidáz szubsztrát kit alkalmazásával tettük láthatóvá, a gyártó által javasolt protokoll alapján. A metszeteket metilénkékkel kontrasztosítottuk.

Western blot analízis a humán izomminták HMGB1 tartalmának meghatározására

A western blot vizsgálathoz az izomszövetekből készült lizátumok teljes proteintartalmát használtuk. Az izomminták egy darabját a műtétet követően azonnal lefagyasztottuk folyékony nitrogénben majd lízis pufferben (20 mM Tris–HCl, 5 mM EGTA, and pH 7.5) homogénre dörzsöltük mozsár segítségével. A szövetlizátumokat 40–50 kHz frekvenciás, 5–10 másodpercig tartó szónikus kavitációnak vetettük alá. Az így előkészített mintákat elektroforézishez alkalmazott oldatban hígítottuk (50 % glicerol, 10 % SDS, 310 mM Tris–HCl, pH 6.8; 100 mM DTT, 0.02 % brómfenolkék) és 10 percig főztük. Mintánként 30 µg fehérjét szeparáltunk 7,5%-os SDS-PAGE gélen, majd a proteineket elektroforetikus eljárással nitrocellulóz membránra juttattuk. Transzfer után a membrán nem specifikus kötőhelyeit 5% zsírmentes tejport tartalmazó foszfát pufferrel blokkoltuk 30 percig, szobahőmérsékleten. Blokkolás után a membránt egy éjszakán át inkubáltuk 4 ֯C-on HMGB1 elleni és aktin elleni elsődleges antitesttel. A membránokat másnap 3x10 percig mostuk PBST oldatban (0.1 % Tween-20 PBS-ben) majd 1 órán keresztül inkubáltuk HRP-vel kapcsolt másodlagos antitestekkel, melyeket 5% zsírmentes tejport tartalmazó PBS-ben hígítottunk. A lumineszcens jeleket megnövelt kemilumineszcenciás eljárással detektáltuk (ECL) a gyártó által javasolt protokollt követve.

Egér eredetű immortalizált sejtvonalakon végzett kísérletek

Egér eredetű sejtvonalak tenyésztése

A C2C12 egy immortalizált egér vázizom sejtvonal, mely egy kifejlett C3H egértörzs harántcsíkolt izomzatából indult. A RAW 264.7 makrofág sejtvonalat Prof. Virág László ajándékozta a kísérleteinkhez. A sejteket Dulbecco által módosított Eagle’s médiumban tenyésztettük, melyet kiegészítettünk 50U/ml penicillinnel, 50µg/ml streptomycinnel, a proliferációhoz 10% fötális borjúszérummal (FBS), a mioblasztok miotubulussá történő differenciáltatásához pedig 2% lószérummal (HS). A sejteket 37֯C-on inkubáltuk 5% CO2 tartalmú termosztátban. A tápoldatot két naponta frissre cseréltük.

Tenyésztési protokoll kokultúrában élő egér sejtvonalak proliferációjának vizsgálatához

A kokultúrában élő sejtek proliferációjának vizsgálatához 3 cm átmérőjű petri-csészék széli részére helyeztünk 105 darab C2C12 sejtet 200 µl médiumban. Ugyanezen csészék középső részén 5x103 darab RAW264.7 sejt tenyésztését indítottuk el 100 µl tápfolyadékban. Miután a sejtek leülepedtek a minimális térfogatú médiumban, gyengéden átmostuk őket foszfát puffer oldattal (PBS), majd 2 ml médiumban folytattuk a tenyésztésüket. Ily módon a kétféle sejttípus egy ideig direkt sejt-sejt kapcsolat nélkül egyazon tápfolyadékban tenyészett. A monokultúrák sejtjeit is a fent leírt elrendezésnek megfelelően helyeztünk el a petri-csészékben, hogy az összehasonlításból eredő hibázás lehetőségét minimalizáljuk. A médiumot két naponta frissre cseréltük. A sejteket May-Grünwald és Giemsa oldattal festettük meg. A műanyag petri-csésze alján ülő, letapadt C2C12 sejteket háromszor mostuk PBS oldatban majd 5 perc metanolos fixálást követően 5 percig festettük Giemsa festékkel. Ezt követően mosási lépés nélkül May-Grünwald oldatot adtunk a sejtekhez, melyet közvetlenül felhasználás előtt csapvízben hígítottunk (25x) és 15 perc szobahőmérsékleten történő inkubációt követően a sejteket csapvízzel óvatosan átmostuk majd hagytuk megszáradni. A sejtekről felvételeket készítettünk, melyeken ImageJ szoftver programmal határoztuk meg a sejtek által lefedett területeket

Tenyésztési protokoll kokultúrában tartott sejtvonalak IL-6 termelésének megfigyeléséhez

96 lyukú sejttenyésztő mikrolemezekre 200 µl térfogatú proliferáltató médiumban 5x102 darab C2C12 sejtet és 50 darab RAW264.7 makrofágot helyeztünk el lyukanként. A tenyésztés harmadik napján a sejteken lévő tápoldatot 2% lószérumot tartalmazó médiumra cseréltük a mioblasztok differenciálódásának támogatására. Az 1,3,5,7, és 9. napokon a médiumot begyűjtöttük, és rövid centrifugálást követően (2000 rpm, 5 perc) -80֯C-ra helyeztük a további felhasználásig. A megfelelő összehasonlítás érdekében a C2C12 és RAW264.7 monokultúrákat is a fent leírt módon gondoztuk.

Tenyésztési protokoll és pravasztatin kezelés az IL-6 citokin vizsgálatához

105 darab C2C12 sejtet szélesztettünk 24 lyukú tenyésztő edénybe, lyukanként 2 ml proliferáltató médiumban. A tenyésztés harmadik napján a médiumot 2% lószérumot tartalmazó, differenciációt segítő tápoldatra cseréltük. A hatodik napon, amikor a tenyészet már jelentős mennyiségű miotubulust tartalmazott 5x104 darab RAW 264.7 makrofágot szélesztettünk a növekvő izomsejtekre. Az így létrehozott kokultúrát 24 órán át kezeltük 500 µM pravasztatinnal szérum mentes DMEM-ben. A tenyésztő médiumot begyűjtés után centrifugáltuk és -80֯C-on tartottuk a tervezett mérésekig. A megfelelő összehasonlíthatóság érdekében monokultúrákat is indítottunk, melyeket a kokultúrákkal azonos módon kezeltünk. Kontrollnak kezeletlen sejteket használtunk.   Tenyésztési protokoll és pravasztatin kezelés a C2C12 és RAW264.7 sejtek proliferációjának vizsgálatához

96 lyukú tenyésztő edényben monokultúrákat indítottunk lyukanként 103 darab C2C12 sejtekkel és 5x102 darab RAW 264.7 makrofágokkal. Miután a sejtek megtapadtak a tenyésztő edény alján, 500 µM pravasztatin kezelést indítottunk 10% FBS tartalmú, proliferáltató médiummal. 24 órás kezelést követően felvételeket készítettünk az egyes lyukakban található tenyészetekről és ImageJ szoftver program segítségével meghatároztuk a sejtek által lefedett területeket.

Tenyésztési protokoll és pravasztatin kezelés a C2C12 sejtek differenciációjának vizsgálatához

5x102 darab C2C12 sejtet szélesztettünk 96 lyukú tenyésztő edény egyes lyukaiba 10% FBS-sel szupplementált proliferáltató médiumban. A harmadik napon a magas szérumtartalmú tenyésztő médiumot alacsony szérum tartalmú differenciáltató tápoldatra cseréltük, majd a negyedik napon 500 µM pravasztatint adtunk a sejteknek. Az 5. 7. 9. napokon a pravasztatinnal kezelt és nem kezelt (kontroll) tenyészeteket óvatosan átmostuk PBS pufferrel majd May-Grünwald Giemsa protokoll szerint megfestettük a tenyészet sejtjeit. A negyedik naptól kezdve a tenyésztő oldatot kétnaponta lecseréltük friss médiumra úgy, hogy a pravasztatinnal kezelt sejtek a médiumcsere alkalmával továbbra is kaptak pravasztatint. A tenyészetről fotókat készítettünk melyeken meghatároztuk a miotubulusok és a festődött sejtmagok számát.

Kísérleti „kóstoltatás” sejtkultúrákon

A kísérlet során az volt a célunk, hogy a miogén és mieloid sejtek „megkóstolják” egymás szolubilis faktorait, citokinjeit, és egyéb anyagcsere termékeit. C2C12 és RAW 264.7 sejteket szélesztettünk 96 lyukú tenyésztő edényekbe. A tenyésztés 5. napján a sejtek felülúszóját begyűjtöttük, 2000 rpm sebességgel 5 percig centrifugáltuk, majd 0,22 µm pórusátmérőjű fecskendőszűrőn átnyomtuk. Az izomsejtekről begyűjtött felülúszó felét kiegészítettük azonos térfogatú friss tápoldattal, s az így hígított médiumot, mely tartalmazta a C2C12 sejtek anyagcsere termékeit, a makrofágokra helyeztük. Hasonló módon jártunk el a RAW 264.7 sejtekről levett felülúszókkal is, melyeket a fenti módon hígítva az izomsejtekre helyeztünk. Az így megcserélt, és friss médiummal is kiegészített tápfolyadékban a monokultúrákat még 24 óráig tenyésztettük 37֯C-on, 5% CO2 -ot tartalmazó termosztátban. 24 óra elteltével a felülúszót begyűjtöttük, centrifugáltuk, leszűrtük, majd ELISA vizsgálat alá vetettük. Kontrollként a monokultúrákkal párhuzamosan, azonos feltételek között tenyésztett kokultúrákat használtunk.   ELISA vizsgálat az IL-6 citokin mennyiségi meghatározására

A sejttenyészetekről származó médium IL-6 koncentrációját a kereskedelmi forgalomban elérhető ELISA kittel mértük a gyártó utasítása alapján. A mérés 3 biológiai párhuzamossal történt

Immuncitokémia az IL-6 kimutatására

A kokultúrában tartott sejteket 3 µg/ml Brefeldin A -val kezeltük 1 órán keresztül, hogy megakadályozzuk a proteinek szállítását az endoplazmatikus retikulum és a Golgi apparátus között. Ezt követően a sejteket háromszor mostuk PBS-sel majd 4%-os paraformaldehid (PFA; pH 7.4) oldattal fixáltuk 15 percig szobahőmérsékleten. Az autofluoreszcencia elkerülésére glicinnel történő kioltást alkalmaztunk, melynek során 5 percig 30 mM glicin-PBS oldatban (pH 7.4) inkubáltuk a tenyészetet. A sejtmembránt 0,5% Tritonx-100-PBS oldattal történő 20 perces kezeléssel tettük átjárhatóvá. A nem-specifikus kötőhelyeket egy órán át blokkoltuk, majd a blokkoláshoz használt oldatot kiegészítettük IL-6 elleni antitesttel és ezzel inkubáltuk a tenyészeteket 4֯C-on egy éjszakán át, nedves kamrában. A sejteket másnap háromszor mostuk 0,1% Tween-20-PBS oldattal majd a PBS-ben hígított másodlagos antitestettel inkubáltuk egy órán keresztül szobahőmérsékleten, nedves kamrában. A tenyészeteket ezután háromszor mostuk PBS-ben majd 5 µl Mowiol 4-88 oldatot rácseppentve üveglappal lefedtük. A kiértékelés során a festés pozitivitását vizsgáltuk, kvantitatív analízist fluoreszcens jelintenzitás alapján nem végeztünk.

MTT teszt a sejtek életképességének meghatározására

A tenyésztés hetedik napján meghatároztuk a kontroll és a pravasztatinnal kezelt C2C12 sejtek életképességét MTT-teszt segítségével. Az MTT teszt egy kolorimetriás vizsgálat, mely alkalmas a sejtek metabolikus aktivitásának értékelésére, valamint az életképes sejtek számának meghatározására. A metabolikusan aktív sejtek képesek endocitózissal fölvenni a tetrazólium-bromid molekulákat (3-[4,5-dimetil-2-tiazolil]-2,5-difenil-2H tetrazólium bromid) melyeket a mitokondriális dehidrogenázok liláskék színű formazán kristályokká alakítanak. A sejteket 30 percig inkubáltuk 0,01% MTT reagenssel 37֯C-on 5% CO2-t tartalmazó termosztátban. Az inkubációs idő leteltével az MTT reagenst is tartalmazó médiumot eltávolítottuk, a sejteket pedig 100 µl DMSO-ban lizáltuk. A szolubilizált sejteket egy tiszta ELISA-mikrolemezre, melyen lemértük a kékes oldat optikai denzitását 550 nm hullámhosszon. A pravasztatinnal kezelt sejtekből származó abszorbanciát a kezeletlen sejtek abszorbanciájának százalékában fejeztük ki.

Statisztikai analízis humán vázizom eredetű sejteken és egér sejtvonalakon végzett kísérletek adataiból

A humán vázizom eredetű sejteken végzett kísérletek adataiból a leíró statisztikákat és a statisztikai teszteket a SigmaPlot 12 programba ágyazott SigmaStat szoftver alkalmazásával számoltuk. A nem normál eloszlású adatok két csoportjának összehasonlítását Mann-Whitney Rank Sum teszttel végeztük. Három ilyen csoport esetén a rangok varianciáját elemezve a Kruskal-Wallis one way módszerét a Dunn-féle módszerrel együtt használtuk, s post hoc páronként teszteltünk (ANOVA on Ranks). A nem-lineáris görbék illeszkedését GraphPad Prism 6.0 programmal számoltuk és hasonlítottuk össze. Az eredményeket átlag ± SEM (átlag standard hibája). A különbségeket 0,05 alatti p érték esetén tekintettük szignifikánsnak. Az egér sejtvonalakon végzett vizsgálatok esetén az adatok legalább három független kísérlet eredményeiből származnak. A statisztikai vizsgálatokhoz ismételten a GraphPad Prism 6.0 szoftvert használtuk. Az értékeket az átlag ± átlagok standard deviációja formában adtuk meg. Az eredmények szignifikanciáját egy utas ANOVA variancia-analízissel és a páronkénti átlagok különbségének vizsgálatára használatos Bonferroni-teszt (Bonferroni multiple comparison) segítségével határoztuk meg. Néhány esetre párosítatlan T-próbát alkalmaztunk

Eredmények

Humán harántcsíkolt izomszöveten végzett vizsgálatok eredményei

Idiopátiás gyulladásos miopátiában szenvedő betegek izommintáiból indított primer sejtkultúrákban a sejtek proliferációs képessége csökken

Humán vázizom szatellita sejtjeiből indított primer sejtkultúrákat hasonlítottunk össze. A szatellita sejtek egy része 9 IIM-ben szenvedő betegtől származott, akik közül hatan még nem kaptak kortikoszteroid kezelést, hárman pedig már kezelés alatt álltak. A szatellita sejtek másik része 7, csípőízületi porckopásban (coxarthrosis) szenvedő pácienstől származott, akik kórtörténetében nem szerepelt IIM. A teljesen egészséges donorok hiányában ezeket a tenyészeteket használtuk referenciaként. A miogén sejtmagok számát normalizáltuk a tenyésztés második napján számolt sejtmagszámra, így korrigáltuk a szatellita sejtek preparálása során keletkezett esetleges eltéréseket. Két paraméteres exponenciális növekedési görbéket illesztettünk az adatokra (y = y0exp(kx)). A nemlineáris illeszkedés és a görbék összehasonlítása során azt találtuk, hogy a három adathalmaz három egyedi görbét fed le (p<0,0001). A k paraméter értékei mutatják a növekedés ütemét, mely coxarthrosis esetén 0,307±0,028, kezeletlen myositises páciensek esetében 0,211±0,035, és kortikoszteroid kezelés alatt álló myositises pácienseknél 0,295±0,043-nak adódott. Ezek az értékek azt jelzik, hogy a szatellita sejtekban, mioblasztokban és miotubulusokban lévő miogén sejtmagok száma kisebb mértékben emelkedik a kezeletlen IIM páciensek biopsziás mintáiból indított primer tenyészeteiben, mint a coxarthrosisos páciensek műtéti anyagából indított sejtkultúráiban. Az IIM-ben szenvedő páciensek standard, kortikoszteroidokkal történő kezelése hatással volt az izmaikból indított primer tenyészetek proliferációs ütemére is, ugyanis növekedési rátájuk a coxarthrosisos páciensek mintáiból indított tenyészetekhez közelített. A tenyészeteket 11 napig tartottuk fenn és vizsgáltuk. A fáziskontraszt mikroszkóp alatt készült felvételek alapján a tenyésztés 6. napján, a proliferáció előrehaladott, de a differenciáció még korai stádiumában, a sejtek morfológiája nem változott. Ebben a stádiumban a coxarthrosisos és IIM tenyészetek miotubulusai 2-10 sejtmagot tartalmaztak, de kisebb a sejtszám és a sejtmagszám is. A tenyésztés 10. napjára a különbség még inkább szembetűnő. A proliferációs rátával szemben a prekurzor sejtek fúziós kapacitása nem károsodott az IIM-ben szenvedő páciensektől származó primer tenyészetekben. A fúziós index adataira illesztett 3 paraméteres szigmoid görbék (y = a/(1+exp(-(x-x0)/b))) nem különböztek egymástól szignifikánsan (p=0,285). A kezeletlen IIM páciensek mintáiból indított tenyészetek esetén a fúziós indexre illesztett görbék enyhe jobbra tolódást mutattak (coxarthrosisos minták tenyészetei: x0 = 2.745 ± 0.25 nap; kezeletlen IIM tenyészetei: x0 = 3.404 ± 0.086 nap), mely arra utal, hogy kissé késett a sejtek fúziója. A kortikoszteroidokkal történő kezelés azonban balra tolta el a fúziós index görbéjét (x0 = 1.831 ± 0.29 nap), s az eltolódás hasonló mértékű volt, mint a kezeletlen myositises görbe eltolódása a coxarthrosisoshoz képest.

Az idiopátiás gyulladásos miopátiában szenvedő páciensek izommintáiban kevesebb a regenerálódó izomrost és a HMGB1 a sejtmagban lokalizálódik

Felnőtt vázizomból készült szövettani metszeteken megfestettük a HMGB1-et. A metszeteket 4 coxarthrosisos, 4 kezeletlen IIM-ben szenvedő és 4 kortikoszteoid kezelt IIM-ben szenvedő páciens izommintáiból készítettük. Néhány páciens mintáit sejttenyésztéshez és hisztológiai festéshez is fel tudtuk használni. A kisebb méretű minták csak egyféle vizsgálathoz voltak elegendőek. Az immunhisztokémiai vizsgálatok során az IIM-ben szenvedő páciensektől származó metszeteken kevesebb volt az izomrostokban a HMGB1 pozitív miogén sejtmag, mint a coxarthrosisos metszeteken. Az infiltráló mononukleáris és endotél sejtek minden csoportban HMGB1 pozitív festődést mutattak. A vázizomrostok minden csoportban tartalmaztak HMGB1 pozitív és HMGB1 negatív magokat is. Mononukleáris sejtes beszűrődést a coxarthrosisos izmokban is találtunk, de a kortikoszteroiddal nem kezelt IIM páciensek mintáiban sokkal hangsúlyosabb volt a gyulladásos infiltráció, melyet CD45-re specifikus festéssel igazoltunk. Az izom keresztmetszetének egységnyi területén a HMGB1 pozitív miogén magok száma szignifikánsan kisebb volt (p<0,05) mind a kezeletlen (402.5 ± 60.2 mm2) mind a kezelt IIM (360.1 ± 77.5 mm2) csoportban a coxarthrosisos kontroll csoporthoz képest (882.74 ± 155.1 mm2). Az izomregeneráció jeleinek azonosítása érdekében megvizsgáltuk az izomrostok centrálisan elhelyezkedő sejtmagjainak arányát. A centrális helyzetű sejtmagokat az izom minták keresztmetszeti felszínén számoltuk. A 11 minta 4 coxarthrosisos betegtől, 4 IIM-ben szenvedő, de kortikoszteroiddal nem kezelt betegtől és 3 IIM-ben szenvedő és metilprednizolon terápia alatt álló pácienstől származott. Az izmok keresztmetszeti képén hat látótérben számoltuk meg a centrális sejtmagokat, átlagoltuk, s az arányt az összes miogén magszámhoz viszonyítva adtuk meg. Azt találtuk, hogy a coxarthrosisos mintákban az összes miogén sejtmag 4,53±1,35%-a centrális helyzetű, s ehhez képest a kortikoszteroid terápiában nem részesülő IIM páciensek mintáiban jelentősen kevesebb a centrális magok száma (p=0,039), az összes miogén magnak csak 1,37±0,51%-a. A kortikoszteroid terápiában részesült páciensek mintáiban ez az arány 2,32±0,62% volt, mely egyik csoport eredményeitől sem tér el szignifikánsan.

Az idiopátiás gyulladásos miopátiában szenvedő páciensek izommintái kevesebb HMGB1-et tartalmaznak, mint a kontroll

Western blot vizsgálattal határoztuk meg 8 coxarthrosisos beteg, 9 kortikoszteroid kezelésben nem részesült IIM páciens és 6 kortikoszteroiddal kezelt páciens izommintáinak HMGB1 tartalmát. Később patológus javaslatára kizártunk 5 mintát, melyek olyan páciensektől származtak, akik nem feleltek meg egyértelműen a diagnosztikai kritériumoknak, vagy a kísérleteink alatt változott meg a diagnózisuk (pl. szisztémás lupus erythematosus). A fennmaradó 23 minta esetében az átlagos relatív optikai denzitásokat aktinra normalizálva a következő eredményeket kaptuk az egyes csoportokban: coxarthrosis esetén 0,488±0,15; kezeletlen myositis esetén 0,157±0,033; kezelt myositis esetén 0,14±0,039. A myositises csoport izommintáinak HMGB1 tartalma szignifikánsan kisebb volt (p<0,05) a coxarthrosisos csoportéhoz képest, de a kezelt és kezeletlen IIM csoportokat egymással összehasonlítva nem találtunk számottevő különbséget

Egér eredetű sejtvonalakon végzett kísérletek eredményei

A kokultúrában történő tenyésztés nem volt hatással a C2C12 és RAW264.7 sejtek proliferációs képességére

A kokultúrában történő tenyésztés nem volt hatással a RAW 264.7 makrofágok és a C2C12 izomsejtek proliferációjára. A kétféle sejttípus egymásra hatását vizsgálva, a sejteket mono-és kokultúrában tenyésztettük és figyeltük, hogyan hatnak egymás proliferációs képességére. Egy nappal a szélesztést követően a sejtek által elfoglalt terület a C2C12 izomsejtek esetében, monokultúrában 2,3±0,9%, kokultúrában 3,1±1,2% (p>0,05), RAW makrofágok esetében monokultúrában 8,0±1,9%, kokultúrában 5,8±2,0% (p>0,05). A kétféle sejttípus növekedési üteme közötti különbség a tenyésztés harmadik napjára vált kifejezetté, amikor a C2C12 sejtek által borított felület monokultúrában 10,1±3,4%, kokultúrában 12,1±5,4% (p>0,05) volt, RAW 264.7 makrofágok esetében pedig monokultúrában 34,6±6,6%, és kokultúrában 31,6±3,6% (p>0,05) volt. A RAW 264.7 sejtek proliferációja a harmadik naptól kezdve szignifikánsan gyorsabbnak mutatkozott a C2C12 sejtekénél monokultúrában (p<0,0001) és kokultúrában is (p<0,0001). A kokultúrában történő tenyésztésnek azonban sem a mioblasztok sem a makrofágok osztódási rátájára nem volt hatása.

A kokultúrában történő tenyésztés fokozta a kokultúra IL-6 termelését

A C2C12 és RAW264.7 sejtek kokultúrában történő tenyésztése serkentően hatott az IL-6 termelésre. A kokultúrában lévő sejtekben immunfestéssel tettük láthatóvá az IL-6 citokint. Azt találtuk, hogy az IL-6 termelés jelen van a proliferáló miogén sejtekben és monocita/makrofágokban továbbá megfigyelhető a miogenezis differenciációs stádiumában fejlődő miotubulusokban is. A sejttenyészet médiumában monitoroztuk a sejtekből felszabadult IL-6 koncentrációját. A tenyésztés 1-3 napján mely a miogenezis proliferációs stádiuma, alacsony IL-6 koncentrációkat mértünk a tenyészetek felülúszójában és nem találtunk szignifikáns különbséget a kokultúrák és a monokultúrák között. A tenyésztés ötödik napjától kezdve az IL-6 koncentrációja a kokultúrák esetében fokozatosan emelkedett, de a monokultúráknál változatlanul alacsony maradt. A hetedik és kilencedik napon az IL-6 koncentráció tovább emelkedett, s a monokultúrák IL-6 termeléséhez képest szignifikánsan magasabb lett. Annak ellenére, hogy a C2C12 és a RAW 264.7 sejtek is szabadítottak fel mérhető mennyiségű IL-6-ot, monokultúrákban a 9 napos tenyésztés alatt végig alacsony volt a citokin koncentrációja.

A pravasztatin fokozta a kokultúra és az izomsejttenyészet IL-6 termelését

A pravasztatin fokozta a kokultúrák IL-6 termelését. A sztatinok ismert gyulladáscsökkentő hatása miatt feltételeztük, hogy a vízoldékony pravasztatin csökkenti a kokultúrák IL-6 termelését. A feltételezés alátámasztásához 500µM pravasztatinnal kezeltünk 6 napos mono-és kokultúrákat, 24 órán keresztül. Az elvárásainkkal ellentétben azt találtuk, hogy a pravasztatin szignifikánsan emelte a sejtek IL-6 termelését mind C2C12 monokultúrában (kontroll: 2,3±0,2 pg/ml; pravasztatin kezelt: 18,0±1,5 pg/ml; p<0,001) mind kokultúrában (kontrol: 129,3±5,8 pg/ml; pravasztatin kezelt: 945,8±50,2 pg/ml; p<0,001). A RAW 264.7 makrofágok monokultúrája esetében pravasztatin kezelés hatására nem találtunk jelentős változást a sejtek IL-6 felszabadításában (kontrol: 2,5±0,1 pg/ml; pravasztatin kezelt: 1,8±0,1 pg/ml; p>0,05).

A pravasztatin csökkentette az izomsejtek proliferációs képességét

A C2C12 sejtek intenzív IL-6 termelése mögött a pravasztatin kezelésre megszaporodott sejtszámot feltételeztük. Megvizsgáltuk a 24 órás monokultúrák proliferációját pravasztatin kezelés mellett. 24 óra elteltével a pravasztatinnal kezelt mioblasztok száma jelentősen csökkent (p<0,01). Ezzel szemben a 24 órás kezelés nem okozott változást makrofágok számában (p>0,05). Ebből arra következtettünk, hogy a kokultúra megnövekedett IL-6 termelését pravasztatin kezelést követően feltételezhetően nem a megnövekedett sejtszám eredményezte. A pravasztatin jelentősen rontotta a C2C12 izomsejtek proliferációs képességét.

A pravasztatin csökkentette az izomsejtek differenciációs kapacitását

A pravasztatin kiemelkedően negatív hatást gyakorolt a C2C12 sejtek proliferációjára, ezért megvizsgáltuk hatását a sejtek differenciációjára is. A fúziós index (FI) kifejezi a miotubulusokban lévő sejtmagok arányát a tenyészet összes sejtmagjához viszonyítva. Differenciálódó C2C12 sejteket 9 napon át kezeltünk pravasztatinnal, s a tenyésztés 7. és 9. napján szignifikánsan (p<0,05) kevesebb miotubulust találtunk a tenyészetekben a kezeletlen kontrollhoz képest. A kontroll tenyészetek esetében a fúziós index az 5. naptól kezdve fokozatosan nőtt, de a pravasztatinnal kezelt tenyészetek esetében nem változott. A kezelt sejtek életképessége azonban a kontroll sejtekéhez volt hasonló (p>0,3). A pravasztatin rontotta a C2C12 sejtek differenciációs képességét.   Összefoglalás

A hiperkoleszterinémia kezelésében elsőként választandó gyógyszerek a sztatinok. Alkalmazásuk során ritkán előfordulhat súlyos, izomkárosító mellékhatás. Munkánk során humán izombiopsziás mintákon és műtéti anyagokon, valamint primer izomsejt tenyészeteken végzett kísérleteinkben tanulmányoztuk a gyulladásos környezet hatását az szatellita sejtek életképességére. Az izomgyulladást C2C12 izomsejtekből és RAW264.7 makrofágokból álló kokultúrákon modelleztük in vitro. A szteroiddal nem kezelt páciensektől származó izmokban a regenerálódó rostok száma kevesebb, valamint az izmokból indított primer tenyészetekben a sejtek lassabban osztódtak a kontrollhoz képest. A páciensek előzetes kortikoszteroid kezelése mérsékelte a vázizmok gyulladásos beszűrődését. A HMGB1-et a szteroid kezeléstől és betegségtől függetlenül az izmok és az infiltrátum sejtmagjaiban találtuk. A szteroid kezelés ellenére is kevesebb HMGB1-et tartalmaztak a myositises páciensek mintái. A kortikoszteroid kezelés nem befolyásolta sem az izmok összes HMGB1 tartalmát, sem a HMGB1 pozitív sejtmagok vagy a regenerálódó rostok számát. A kokultúrában tenyésztett sejtek nem voltak hatással egymás proliferációs képességére, azonban az együttélés fokozta a kokultúra IL-6 termelését. Az izomsejtek IL-6 termelése a differenciáció stádiumában makrofágok nélkül is emelkedett, de nem érte el a vele egy stádiumban élő kokultúra citokintermelését. A pravasztatin kezelés tovább fokozta az izomsejtkultúra és a kokultúra IL-6 termelését is és rontotta az izomsejtek osztódási és fúziós képességét. A makrofágok IL-6 termelésére vagy osztódására nem volt hatással. Eredményeink arra utalnak, hogy a pravasztatin egyes esetekben fokozhatja az izomgyulladást, s a folyamatban a HMGB1-nek is lehet szerepe.

SHORT THESIS FOR THE DEGREE OF DOCTOR OF PHILOSOPHY (PHD)

Effect of the inflammatory environment and pravastatin on skeletal muscle regeneration

by Karolina Cseri

Supervisor: László Csernoch, PhD, DSc, Dr. Tőzsérné Dr. Szilvia Benkő, PhD

UNIVERSITY OF DEBRECEN DOCTORAL SCHOOL OF MOLECULAR MEDICINE

DEBRECEN, 2022.   Effect of the inflammatory environment and pravastatin on skeletal muscle regeneration

By Karolina Cseri, MSc

Supervisor: László Csernoch, PhD, DSc, Dr. Tőzsérné Dr. Szilvia Benkő, PhD

Doctoral School of Molecular Medicine, University of Debrecen

Head of the Defense Committee: Zoltán Papp, MD, PhD, DSc

Reviewers: Beáta Lontay, PhD, János Almássy, PhD Members of the Defense Committee: Tamás Ivanics, PhD Attila Tóth, PhD, DSc The PhD Defense takes place at the Library, Department of Physiology, Faculty of Medicine, University of Debrecen 18th July, 2022 Introduction

Myocardial infarction and ischemic heart disease were almost completely unknown before the 1900s. More and more cases were reported after 1920, and by the 1930s it was already causing a serious public health problem. According to statistics, there is currently one heart attack in America every tenth of a second. 50,000 people die of heart attacks in Hungary every year. Today, it is a widely accepted view that heart loss is due to a sedentary lifestyle, excessive food intake, over-consumption of refined foods, and poor diet. There are opponents of the cholesterol-raising effect of diet and the theory of the link between high blood fat and heart mortality, but the popularity of cholesterol-lowering statins has been unbroken for years. Their risk lies in the fact that statins, in addition to blocking the own cholesterol synthesis of the cells, also affect metabolism in other ways, self-regulatory mechanisms that go beyond our current knowledge. As a side effect, autoimmune muscle involvement or fatal renal failure is becoming more common.

Idiopathic inflammatory myopathies

Idiopathic inflammatory myopathies (IIMs) include heterogeneous groups of neuromuscular diseases commonly referred to as myositis. For decades, these were divided into three subgroups based on the presence and severity of muscle weakness, myositis, and extramuscular symptoms. In 1975, following the work of Bohan and Peter, only two groups were considered, polymyositis (PM) and dermatomyositis (DM), and in 1995, Griggs et al. Also described inclusion body myositis (IBM) as a third group. In 2003, an international conference (European Neuromuscular Center International Workshop - 2003 ENMC-IIM) expanded the existing categories with immune-mediated necrotizing myopathy (IMNM) and non-specific myositis. Based on the research results of the past decade, the discovery of myositis-specific antibodies (MSA), and extensive clinical experience, requires to develop a new classification system. Formulating a diagnosis, the EULAR / ACR (European League Against Rheumatism / American College of Rheumatology) classification criteria should be considered first, and then the subgroup can be defined based on a multi-step system of criteria. The current categorization distinguishes six subgroups: polymyositis (PM) - which has become a subset of immune-mediated necrotizing myopathy (IMNM), inclusion body myositis (IBM), amyopathic dermatomyositis (ADM), dermatomyositis (DM), and juvenile dermatomyositis (JDM). If the symptoms meet the criteria set for EULAR / ACR IIM, the next consideration is the age at the onset of the first symptom. If complaints occurred under the age of 18, juvenile dermatomyositis can be diagnosed in the presence of skin symptoms, and juvenile myositis in the absence of skin symptoms. If there is no skin symptom, but the patient complains of weakness of the flexor muscles of the fingers that does not respond to therapy, or rimmed vacuoles are confirmed on the muscle biopsy samples, then the diagnosis is inclusion body myositis (IBM). If the stubborn weakness of the flexor muscle is not characteristic, and the presence of rimmed vacuole is not confirmed histology, the diagnosis is polymyositis. Over the age of 18, when skin symptoms also occur, the question is whether there is a symmetrical and progressive weakness in the upper or lower limbs, or a weakening of the neck flexor muscles relative to the neck bending muscle, or a proximal weakness of the lower extremities relative to the distal regions. If at least one of these symptoms is present, the diagnosis is dermatomyositis; in the absence, the diagnosis is amyopathic dermatomyositis.

Cholesterol

Cholesterol is a lipid-based, sterane framed organic molecule. It is an essential component of the membrane of human and animal cells. Researchers were initially skeptical about the link between cholesterol and coronary heart disease, but later more and more studies have been published that have demonstrated the role of cholesterol in the development of cardiovascular disease. Cholesterol serves as a precursor for the biosynthesis of bile acids, steroid hormones, and vitamin D. Every cell in the body is able to synthesize, and in vertebrates it is produced in the highest amount by liver cells. Subsequent studies have shown that mortality from coronary heart disease is mainly attributable to low-density lipoprotein (LDL) cholesterol, which accounts for 70% of total cholesterol. a theory has emerged that elevated total, more specifically LDL, cholesterol levels can cause coronary artery disease. At present, millions of people in developed countries and in Hungary are killed by cardiovascular diseases caused by atherosclerosis, which affect society not only with premature death but also with long years of disability.

Statins

Statins are the most effective, widely used drugs in hypercholesterolemia for reducing the level of low-density lipoprotein cholesterol and triglycerides by inhibiting 3-hydroxy-3methyl coenzyme a (HMG-CoA) reductase thus blocking the key enzyme of the synthesis of cholesterol. Beside their therapeutic advantages, statins may rarely induce serious muscle related adverse effects. Statininduced myopathy, according to its pathogenesis, can either be toxic non-autoimmune or statin-induced necrotizing autoimmune myopathy (sinam). Toxic myopathy can be focal or generalized, severity of symptoms is dose-dependent. SINAM is a rare and severe form of druginduced myopathy in which statin treatment initiates an iutoimmune process which cannot be reversed by drug withdrawal. We have previously shown that statin treatment decreased the proliferation and fusion of skeletal myotubes in cell culture and negatively regulated calcium homeostasis of adult skeletal muscle fibers. These effects can contribute to the observed myopathies in statintreated patients. Besides the direct action of statins on muscle cells, their effects on the macrophages may also play a pathogenic role in statin-induced myopathy.

High mobility group box 1 protein (HMGB1)

In case of senior patients, the appearance of muscle symptoms is initiated by statin therapy to lower cholesterol. In some cases, discontinuation of treatment does not resolve the complaints, as the symptoms are perpetuated by autoimmune processes. Molecules released from damaged cells, such as HMGB1, continue to trigger inflammation. Thus, HMGB1 may play a pathogenic role in the development of myositis, muscle weakness, and muscle pain in autoimmune diseases such as idiopathic inflammatory myopathies or rheumatoid arthritis. “High Mobility Group” proteins are non-histone type chromatin proteins that are present in all cell types. It is actively released from living cells and passively from dead cells. In the extracellular space, it can activate the natural (innate) immune system by providing a warning function. Large amount of HMGB1 released into the extracellular space has an inflammatory effect. HMGB1 consists of two positively charged DNA binding subunits (boxes A and B) and a negatively charged acidic terminus. It contains two nuclear localization signal segments (amino acids NLS1: 28-44; amino acids NLS2: 179-185) that play an important role in the transport of the protein to the nucleus. The 50-183 amino acid sequence is responsible for RAGE binding. Extracellular cytokine activity is located in box B and can be antagonized by the cleaved box A subunit. The cysteine at position 106 in box B is essential for HMGB1 to activate cytokine release. The transcriptional stimulating effect of the protein is provided by the C-terminal acidic terminus. Currently known, proven receptors are toll-like receptor-4 (TLR-4) and RAGE (receptor for advanced glycation end products). Many receptor systems have been associated with HMGB1, but these are presumably not specific for HMGB1 but for molecules complexed with HMGB1. The effect of the relationship between HMGB1 and RAGE is currently the subject of intensive research. Overall, studies indicate that binding of HMGB1 to RAGE directly activates the NF-κB pathway and the resulting cytokine production. Both TLR-4 and RAGE receptors are found on macrophages, but if TLR-4 is functionally inactive or absent, none of the isoforms of HMGB1 can stimulate the cell to produce cytokines. Thus, it can be hypothesized that the HMGB1-RAGE complex is not able to directly induce cytokine production.

Aims and perspectives

-How does the in vivo inflammatory environment affect the ability of muscle satellite cells to proliferate and differentiate?

-What effect can in vivo methylprednisolone treatment have on myogenesis?

-How does corticosteroid treatment affect the ability of primary cultures initiated from myositis to divide and fuse?

It is a well-known phenomenon in the clinic that statin therapy causes chronic myopathy in some patients by initiating autoimmune processes. This experience raised several questions:

-How do macrophages and myogenic cells affect each other's proliferation in statin-induced myopathic muscle?

-Is pravastatin, as a known anti-inflammatory substance, able to reduce myositis?

• How does pravastatin affect the ability of myogenic cells to proliferate and differentiate?   Materials and methods

Experiments and examinations performed on striated muscle tissue of human origin

Ethical approval

The study protocol was approved by the Human Ethics Committee of Medical and Health Science Center, University of Debrecen. Written informed consent was obtained from the patients before they entered the study.

Biopsy specimens and muscle samples dissected in orthopaedic surgery

Biopsy specimens were obtained either from human subjects suffering from PM (n = 15) or DM (n = 6) and from osteoarthritic patients undergoing orthopaedic surgery (n = 12). Thirteen IIM patients of the 21 were not treated with corticosteroids before biopsy while eight patients received methylprednisolon (12–16 mg/day). The age of IIM patients varied between 23 and 74 years (52.7 ± 13.3; mean ± SD, n = 21), 3 men and 18 women participated in the study. The biopsy was carried out by surgical intervention under local anaesthesia from the altered proximal muscles (deltoid or quadriceps femoris, whichever was more affected in the given patient). Muscle samples from the gluteus medius were excised during surgical intervention directed to hip replacement in the patients with coxarthrosis (age: 65.3 ± 8.8, n = 12; male: 4, female: 8).

Primary cell culture of human skeletal muscle satellite cells

For mechanic and enzymatic dissociation of satellite cells from biopsy pecimens and for culturing. Briefly, the biopsy specimens were digested in a Ca2+ and Mg2+ free phosphate buffer with 0.75 mg/ml type 2 collagenase and trypsin. Dissociated cells were plated on glass coverslips in HAM’s F12 growth medium containing 5 %foetal bovine serum (FBS) and 5 % horse serum (HS), and were kept at 37֯C in a 5 % CO2 containing atmosphere. After 4 days the cells were placed in a differentiating medium supplemented with 2 % HS and 2 % FBS for further 7 days to initiate differentiation.

Examination of cell proliferation and differentiation

Primary cultures of human striated muscle cells were imaged daily from the 2nd to the 11th day after plating using a Canon EOS-300D digital single lens reflex camera mounted on a phase contrast microscope. Five regions of interest per dish were imaged every day. Myogenic nuclei were marked manually and morphometric analysis was done on these images. Cell proliferation was characterised by the increase in the number of myogenic nuclei normalised to the value at the 2nd day of culturing. Differentiation was assessed by fusion index (number of myogenic nuclei in the myotubes divided by the total number of the myogenic nuclei).

Immunohistochemistry for HMGB1

For immunohistochemistry (IHC) formalin-fixed, paraffinembedded muscle samples were used as described earlier (Kistama´s et al. 2013). Briefly, the HMGB1-specific primary antibody (diluted in phosphate-buffered saline containing 1 % bovine serum albumin, monoclonal anti-HMGB1 antibody raised in mouse, was used in a 1:500 dilution (final concentration 2 µg/ml). Following overnight incubation with primary antibody, sections were washed (phosphate-buffered saline, 3 9 10 min) and incubated with horseradish peroxidaseconjugated secondary antibody (15 min, room temperature, Super SensitiveTM One-Step Polymer-HRP Detection System). The reaction was visualized by VECTOR DAB peroxidase substrate kit according to the manufacturer’s protocol. Haematoxylin staining was used for nuclei counter stain (10 s). Tonsil sections were used as a positive control. Negative controls were made using 1 % BSA without primary antibody.

Immunohistochemistry for CD45

Formalin-fixed, paraffin-embedded sections of human skeletal muscle were used for IHC. Paraffin sections were deparaffinized, rehydrated, and incubated in 0.3 % H2O2 in distilled water for 15 min. For antigen retrieving, the slides were incubated with Tris–EDTA buffer (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA solution, 0.05 % Tween 20, pH 9.0) in boiling pressure cooker (100֯C) for 20 min. To reduce non-specific binding, slides were incubated in 5 % BSAPBS. Tissue sections were incubated with monoclonal mouse anti-human CD45, in 2.5 % BSA-PBS at a 1:50 dilution for 1 h at room temperature in a humidity chamber. 2.5 % BSA-PBS served as a negative control for secondary antibody. Peroxidase-labelled polymer conjugated to goat anti-rabbit immunoglobulin antibody was used as secondary reagent. The microscopic visualization was made using the VECTOR VIP peroxidase substrate kit.

Western blot analysis

Total protein content of tissue lysates were examined by western blot analysis. Dissected muscle pieces were frozen in liquid nitrogen immediately and homogenised in a mortar with lysis buffer (20 mM Tris–HCl, 5 mM EGTA, and pH 7.5). Tissue lysates were ultrasonicated (40–50 kHz, 5–10 s), diluted in electrophoresis sample buffer (50 % glycerol, 10 % SDS, 310 mM Tris–HCl, pH 6.8; 100 mM DTT, 0.02 % bromophenol blue) and boiled for 10 min. About 30 lg protein was separated by 7.5 % SDS-PAGE gel. Proteins were transferred electrophoretically to nitrocellulose membrane. Membranes were blocked with 5 % non-fat dry milk in PBS (30 min, room temperature), and incubated overnight at 4֯C with anti-HMGB1 primary antibody (1:700; mouse monoclonal anti-HMGB1 antibody) and rabbit anti-actin primary antibody (1:1500). After washing with PBST (0.1 % Tween-20 in PBS) membranes were incubated with HRP-conjugated secondary antibodies (1:1000) HRP-conjugated goat antirabbit and anti-mouse IgG in PBS containing 5 % non-fat dry milk for 1 h. Luminescence signals were detected by enhanced chemiluminescence (ECL) reaction according to the manufacturer’s instruction.

Experiments on mouse immortalized cell lines

Cell culturing

Murine C2C12 skeletal muscle cell line was obtained from the European Collection of Cell Cultures (ECACC). RAW 264.7 mouse macrophage cell line (American Type Culture Collection) was a kind gift of Prof. L. Virágh (Department of Medical Chemistry, University of Debrecen, Debrecen, Hungary). Cells were cultured in Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM-high glucose, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) supplemented with 50 U/ml penicillin, 50 μg/ml streptomycin, 10% fetal bovine serum (FBS) for proliferation and 2% horse serum (HS) for myoblast differentiation and were kept at 37°C in an atmosphere containing 5% CO2. Medium was changed to fresh in every second day.

Cell culturing protocol for examination of the proliferation of co-cultures

For monitoring the proliferation in the co-culture, 105 C2C12 cells in 200 μl medium were seeded on the marginal zone of a 3 cm petri dish, and 5×103 RAW264.7 cells in 100 μl medium were seeded on the center of the same dish. When cells were settled to the surface, 2 ml culture medium was added after a gentle rinse with phosphate buffered saline (PBS). Hence, the two cell types were cultured together without direct cellcell contact for a while. Monocultures were seeded in the same manner for accurate comparison. Medium was changed every second day. Cells were stained with May-Grünwald and Giemsa solution according to the protocol. At the bottom of the plastic cell-culture plate C2C12 cells were washed 3 times with PBS, fixed in methanol for 5 min and stained with Giemsa solution (Molar Chemicals Kft, Halásztelek, Hungary) for 5 min. Next, May-Grünwald (25× dilution in tap water) solution was added to the cells. 15 min later cells were washed in tap water and let dried. Photos were taken by a cell imaging system and were analyzed with ImageJ software to determine the area covered by cells.   Cell culturing protocol for monitoring the IL-6 production of co-cultures

5×102 C2C12 cells and 50 RAW264.7 macrophages were mixed and seeded on a 96-well-plate in 200 μl proliferating medium. On day 3 growth medium was exchanged to one supplemented with 2% HS to facilitate myoblast differentiation. On day 1, 3, 5, 7, and 9 culture medium were collected, centrifuged (2000 rpm, 5 min) and stored at −80°C until further use. For proper comparison, C2C12 and RAW 264.7 cell monocultures were seeded and handled in the same manner.

Cell culturing and pravastatin treatment protocol for IL-6 cytokine assay

105 C2C12 cells were seeded on 24-well-plates in 2 ml growth medium and on day 3 the medium was changed to medium extended with 2% HS to start myoblast differentiation. On day 6, when cultures contained considerable amount of myotubes, 5×104 RAW 264.7 macrophage cells were seeded on muscle cells, and the co-culture was treated with 500 μM pravastatin for 24 h in serum-free DMEM. Culture medium was collected, centrifuged, and stored at −80°C until use. For proper comparison monocultures were cultured and handled in the same manner. Non-treated cells were used as controls.

Cell culturing and pravastatin treatment protocol for the examination of cell proliferation

103 C2C12 cells and 5×102 RAW 264.7 macrophages were seeded on 96-well-plates in monocultures. After cells settled to the bottom of the plate, 500 μM pravastatin was added to the wells in growth medium containing 10% FBS. after 24 h, photos of the wells were taken, and the area covered by cells was determined by ImageJ software.

Cell culturing and pravastatin treatment protocol for the examination of C2C12 cells differentiation

5×102 C2C12 cells were seeded on 96-well-plates in 10% FBS containing growth medium. On day 3 medium was changed to low serum containing differentiating medium, and on day 4 pravastatin (500 μM) was added to the cells. On day 5, 7, and 9 treated and non-treated control cells were washed carefully in PBS and stained according to May-Grünwald Giemsa. Starting at day 4 culture medium was changed in every second day to fresh medium with or without pravastatin (treated and non-treated cultures, respectively). Photos of the cultures were taken, and the number of myotubes and the stained nuclei were counted.

“Cross-feeding” experiment on cell cultures

On the 5th day after seeding RAW 264.7 or C2C12 cells on 96-well-plates, culture medium was collected from monocultures, centrifuged (2000 rpm, 5 min), the supernatant was filtered (0.22 μm sterile syringe filter, Sigma-Aldrich). Half the volume of C2C12 cell culture medium supplemented with equal amount of fresh medium was added onto RAW 264.7 macrophages, and vice versa. After 24-h culturing, on day 6, the culture medium was collected again, centrifuged, filtered as previously described and used for ELISA measurement. Culture medium from parallel co-culture without cross-feeding was used as control.

IL-6 cytokine measurement by ELISA

Concentration of IL-6 in cell culture medium was determined by commercially available ELISA kit according to the manufacturer’s instructions. For testing we used 3 biological replicates.

IL-6 fluorescent staining

Co-cultured cells were treated with 3 μg/ml Brefeldin-A (Sigma-Aldrich) for 1 h to inhibit the protein transport from the endoplasmic reticulum to the Golgi apparatus. Cells were washed three times in PBS and fixed in 4% paraformaldehyde (PFA) (pH 7.4) for 15 min at room temperature. After quenching formaldehyde crosslinking reaction with glycine (30 mM glycine in PBS, pH 7.4, 5 min) cells were permeabilized with 0.5% TritonX-100 in PBS for 20 min. Non-specific binding sites were blocked for 1 h, then with primary antibody against IL-6 overnight at 4°C. Cells were washed three times in 0.1% Tween-20 in PBS and incubated with secondary antibody for 1 h at room temperature. After washing three times in PBS cells were covered by Mowiol 4-88 and glass coverslips. Only positivity of staining was evaluated without quantitative measurement of fluorescence intensity.

Measurement of cell viability using MTT-assay

On day 7 of culturing we determined the viability of control and pravastatin treated C2C12 cells by MTT assay. Briefly, in metabolically active cells mitochondrial dehydrogenases reduce the yellow MTT to bluish formazan product. Cells were incubated with 0.01% MTT reagent for 30 min at 37°C in an atmosphere containing 5% CO2. After incubation, culture medium was discarded, and cells were lysed in 100 μl DMSO. Solubilized cells were transferred to a clear ELISA plate and optical density was measured at 550 nm. The absorbance obtained from pravastatin-treated cells was expressed as a percentage of that obtained from untreated control cells. Statistical analysis

Descriptive statistics and statistical test results were calculated using SigmaPlot 12 with integrated SigmaStat (Systat Software Inc., Chicago, IL, USA). Mann–Whitney Rank Sum Test was used for comparison of two groups of non-normally distributed data. When three such groups were compared, Kruskal–Wallis one way analysis of variance on ranks (ANOVA on Ranks) was used in conjunction with Dunn’s method for post hoc pairwise testing. Nonlinear curve fits were calculated and compared using GraphPad Prism. Results are presented as mean ± SEM (standard error of the mean). Differences were regarded significant when p did not exceed 0.05. For studies in mouse cell lines, all data are representative of at least three independent experiments. Averages are expressed as mean ± standard deviation (SD). Differences were assessed using one-way analysis of variance (ANOVA) and all pair wise multiple comparison procedures (Bonferroni multiple comparison). In some cases unpaired T-test was used.

Results

Results of studies on human striated muscle tissue

Decreased cell proliferation capacity in primary cell cultures initiated from muscle samples from patients with idiopathic inflammatory myopathy

Primary cell cultures of human skeletal muscle satellite cells derived from IIM patients without corticosteroid treatment (n = 6) were compared to cell cultures derived from IIM patients already receiving corticosteroid treatment (n = 3) and cell cultures derived from patients suffering from coxarthrosis (n = 7) to provide a reference base. Myogenic nuclei counts were normalized to the number of such nuclei on the 2nd day of culturing to correct for any difference caused by the uneven cell numbers in the initial preparation. Two-parameter exponential growth curves (y = y0 * exp(k * x)) were fitted. Nonlinear fitting and curve comparison showed that the three datasets are best fitted with three individual curves (p<0.0001). The k parameter values showing the growth rate were found to be 0.307 ± 0.028, 0.211 ± 0.035, and 0.295 ± 0.043 for coxarthrotic, untreated myositis patients, and corticosteroid- treated myositis patients, respectively. These values clearly indicate that the number of myogenic nuclei (nuclei in satellite cells, myoblasts and myotubes) shows a lower rate of increase in cultures derived from untreated IIM patients when compared to the findings in coxarthrotic primary cultures. Standard corticosteroid treatment of IIM patients increases the growth rate of primary muscle cell cultures to the coxarthrotic level. These effects were observed throughout a 11 day period of culturing. Typical images used for these calculations are shown for all groups and two different time points. In contrast with the proliferation rate, the fusion capacity of precursor cells to adult skeletal muscle fibers is not impaired in primary cultures from patients with a confirmed diagnosis of IIM. The 3-parameter sigmoidal curves (y = a/(1 + exp(-(x-x0)/b))) fitted to the fusion index data are not significantly different from each other (p = 0.285). The curve for the cultures from untreated IIM patients is, however, somewhat shifted to the right: x0 = 2.745 ± 0.25 and 3.404 ± 0.086 days (coxarthrosis and untreated IIM, respectively), reflecting a slight delay in cell fusion. In addition, treatment with corticosteroids elicits a shift to the left (x0 = 1.831 ± 0.29 days) similar in size to the effect of untreated myositis compared to the coxarthrotic curve. Phase contrast micrographs clearly demonstrate that the morphology of skeletal muscle cells is not altered in an advanced stage of proliferation and early stage of differentiation, on the 6th day of culturing. At this time, myotubes contain 2–10 nuclei in both coxarthrotic cultures and cultures from IIM patients, but the lower number of cells and nuclei are clearly evident on the images the 10th day of culturing, these differences are even more pronounced.

Muscle samples from patients with idiopathic inflammatory myopathy show less regenerating muscle fiber and HMGB1 localized in the nucleus

Histological sections of adult muscle strips were stained for HMGB1in patients with coxarthrosis (n = 4) or with IIM without and with corticosteroid treatment (n = 4 in both groups). Samples from some patients were used in both the cell culturing and immunohistochemical studies, while others were used only in one kind of study. Immunohistochemical studies revealed less HMGB1 positive myogenic nuclei in the muscle fibres of IIM patients than in the coxathrotic group. The infiltrating mononuclear cells and endothelial cells showed HMGB1 positivity in all groups. The nuclei of the skeletal muscle fibres were either HMGB1+ or HMGB1- in all groups. Regions with mononuclear cell infiltration were also found in the muscles of coxarthrotic patients but the inflammatory infiltration was more prominent in the samples from patients with IIM without corticosteroid treatment. The number of HMGB1+ myogenic nuclei per cross sectional area was significantly (p<0.05) lower in both the untreated (402.5 ± 60.2 mm-2) the treated (360.1 ± 77.5 mm-2) IIM groups than in the coxarthrotic group (882.74 ± 155.1 mm-2). In order to identify signs of muscle regeneration the ratio of myotubes with central nuclei was investigated. Centralized nuclei were counted in transversal sections of skeletal muscle samples obtained from coxarthrotic patients (n = 4), patients suffering from IIM and not yet receiving corticosteroid treatment (n = 4) and patients suffering from IIM and receiving methylprednisolon treatment (n = 3). An average of six regions of interests were screened for centralized nuclei within the cross-section of the skeletal muscle fibre and the ratio of such nuclei was determined in proportion to the total number of myogenic nuclei. We found that in samples from coxarthrotic patients 4.53 ± 1.35 % of all myogenic nuclei were central, while in IIM patients before corticosteroid treatment the percentage decreased to 1.37 ± 0.51 %, which is a significant reduction (p = 0.039). The ratio was 2.32 ± 0.62 % in IIM patients already receiving corticosteroid treatment, which does not differ significantly from either of the two other groups.

Muscle samples from patients with idiopathic inflammatory myopathy contain less HMGB1 than controls

Western blots were performed to determine the level of HMGB1 protein in samples from coxarthrotic patients (n = 8), IIM patients without corticosteroid treatment (n = 9) and IIM patients with corticosteroid treatment (n = 6). Five samples were excluded later due to ineligible diagnoses (e.g. systemic lupus erythematosus) provided by the pathologist. For the 23 remaining samples the average relative optical densities (normalized to the level of actin) per group were 0.488 ± 0.15, 0.157 ± 0.033, and 0.14 ± 0.039 (coxarthrosis, myositis untreated, and myositis treated; respectively). The decrease of HMGB1 levels between the coxarthrotic group and the two groups of IIM patients proved to be significant (p<0.05), but the difference between the treated and untreated myositis groups was not significant.

Results of experiments on mouse cell lines

Proliferation was not affected by co-culturing of RAW 264.7 macrophages and C2C12 muscle cells

To study the effects of two cell types on each other, proliferation of C2C12 myoblasts and RAW 264.7 macrophages was examined in mono- and co-culture. One day after seeding the area covered by C2C12 cells was 2.3 ± 0.9% in monoculture and 3.1 ± 1.2% in co-culture (p > 0.05), and in case of RAW 264.7 cells it was 8.0 ± 1.9% in monoculture and 5.8 ± 2.0% in co-culture (p > 0.05), respectively. On day 3 the difference between the two cell types was more prominent, the area covered by C2C12 cells was 10.1 ± 3.4% in monoculture and 12.1 ± 5.4% in co-culture (p > 0.05) and in case of RAW 264.7 cells it was 34.6 ± 6.6% in monoculture and 31.6 ± 3.6% in co-culture (p > 0.05). Rate of RAW 264.7 cells proliferation was significantly higher than C2C12 cells from day 3 of culturing both in monoculture (p < 0.0001) and co-culture (p < 0.0001). On the other hand, co-culturing had no effect on the rate of cell division neither for myoblasts or for macrophages (p > 0.05).

IL-6 production is enhanced in co-culture of C2C12 and RAW 264.7 cells

By using immunostaining method to detect IL-6 production in co-culture of C2C12 and RAW 264.7 cells, IL-6 production was found in both myogenic cells and monocytes/macrophages in the proliferation and differentiation phase of myogenesis. Monitoring the IL-6 content in the culture medium showed low level of IL-6 release without significant difference between the monocultures and coculture during proliferation phase of myogenesis (1–3 days) of culturing. On day 5 IL-6 concentration in cocultures started to elevate gradually while it remained low in both monocultures. The amount of released IL-6 increased even further and was significantly higher compared to monocultures on day 7 and 9. Even though both C2C12 and RAW 264.7 cells can release measurable amount of IL-6, its level remained low in the culture medium of monocultures during the 9-day culturing period.

Pravastatin enhances IL-6 production of co-culture

Since statins have been shown to reduce inflammation, we hypothesized that the water-soluble pravastatin would decrease IL-6 level in co-cultures. To test this hypothesis, we treated 6-day-old monocultures and co-cultures with 500 μM pravastatin for 24 h. However, in contrast to our hypothesis, we observed that pravastatin significantly increased IL-6 production in C2C12 monocultures (control 2.3 ± 0.2 pg/ml; pravastatin treated 18.0 ± 1.5 pg/ml, p < 0.001) and in co-cultures as well (control 129.3 ± 5.8 pg/ ml; pravastatin 945.8 ± 50.2 pg/ml; p < 0.001) and did not modify considerably the IL-6 production of RAW 264.7 monocultures (control 2.5 ± 0.1 pg/ml; pravastatin 1.8 ± 0.1 pg/ml; p > 0.05).

Pravastatin significantly impairs the proliferative ability of C2C12 muscle cells

We then hypothesized that increased IL-6 production of coculture might originate from the increased number of cells due to pravastatin treatment. Thus, we examined the proliferation of 24-hour-old monocultures treated with pravastatin. Number of myoblasts decreased significantly after 24 h pravastatin treatment (p < 0.01). In contrast, to that number of macrophages was unchanged after 24 h treatment (p > 0.05). Thus, it is unlikely that the elevated IL-6 level in the co-culture after pravastatin treatment is the result of enhanced proliferation capacity of cells.

Pravastatin impairs C2C12 differentiation

Since pravastatin has a considerable negative effect on the proliferation of C2C12 cells, we studied the effects of pravas tatin on differentiation, too. Fusion index (FI) represents the ratio of nuclei in myotubes to all nuclei in the cell culture. Differentiating C2C12 cells were treated with pravastatin for 9 days, and we detected significantly lower number of myotubes (p < 0.05) on the 7th and 9th days of culturing than in untreated cultures. While fusion index of control cells showed gradual increase from day 5 to 9, treated values has not been changed at all. However, pravastatin treated cultures had similar (p > 0.3) viability to those under control conditions.   Summary

Statins are the first line drugs for treating hypercholesterolemia, but rarely, they can have severe, muscle-damaging side effects. We performed experiments on human surgical and biopsy speciments, primary muscle cell cultures, and mouse cell lines. Muscle inflammation was modeled in vitro on cocultures of C2C12 and RAW264.7 cells. The number of regenerating fibers was lower in the muscles derived from patients without steroid treatment, and in the primary cell cultures initiated from their samples, the rate of proliferation was slower compared to the controls. Previous corticosteroid treatment reduced the inflammatory infiltration in skeletal muscle. HMGB1 was found in the nuclei of muscle cells and infiltrating cells regardless of disease or steroid treatment. Despite pre-treatment, samples derived from patients with myositis contained less HMGB1. Corticosteroid treatment had no effect either on total HMGB1 content of muscles or the number of HMGB1 positive nuclei or regenerating fibers. In cocultures cells did not affect on each other’s proliferative capacity, however coexistence increased the IL-6 production of the coculture. At the stage of differentiation, IL-6 production of muscle cells was elevated even without the presence of macrophages, but the cytokine level was not as high as in a coculture of the same age. Pravastatin treatment further increased IL-6 production of muscle monocultures and cocultures and impaired their proliferation and differentiation ability. Pravastatin did not affect on IL-6 production or proliferation of macrophages. Our results suggest that pravastatin may increase myositis in some cases and that HMGB1 may play a role in this process.