Vizsgálataink során a miozin foszfatáz szerepét tanulmányoztuk idegi folyamatokban, valamint az SMTNL1 hatását elemeztük indukált inzulinrezisztencia modellben C2C12 sejteket használva. A miozin foszfatázt először a simaizomzatban katalizált reakcióján (MLC20 defoszforilációja) keresztül írták le. A miozin könnyű láncot defoszforilálva a simaizomzat kontraktilis állapotát szabályozza. A miozin könnyűláncon kívül számos citoszkeletális célpontját is azonosították úgy, mint az ERM vagy Tau fehérjék. Felépítését tekintve egy PP1 enzimcsaládba tartozó katalitikus alegységből (PP1cδ), egy MYPT1 szabályozó/célra irányító alegységből, valamint egy M20/21 alegységből áll. Első felfedezése óta már bizonyosságot nyert, hogy ez az enzim nem csak a citoszkeletális sejtalkotók defoszforilációján keresztül tölti be élettani szerepét. Egyrészt nem kizárólag a simaizomzatban fordul elő, másrészt számos szubsztrátot írtak le, melyeket a MP képes defoszforilálni, ezáltal rendkívül sok sejtélettani folyamatra képes hatással lenni. Szerepe van a génexpresszió szabályozásában (PRMT5 fehérjén keresztül), a sejtciklus előrehaladásában, vagy akár az ingerület átvivő anyagok felszabadulásában a SNARE komplex elemeinek defoszforilációja révén. A MP aktivitását sok tényező képes megváltoztatni, a kisméretű inhibitor molekuláktól kezdve az endogén kölcsönható partnereken át a MYPT1 alegység foszforilációjáig. A MP foszforilációs szabályozásában a RhoA-aktivált protein kináz (ROK) játszik fontos szerepet, mely a MYPT1 alegység foszforilációján keresztül képes gátló hatást kialakítani. A ROK és a MP enzimpáros sok esetben egymásnak ellentétes módon hatnak ugyanazon a szubsztáron. Sikerült felderíteni az ingerület átvivő anyagok felszabadulásáért felelős SNARE komplex egyik tagjának, a SNAP-25 fehérjének a kölcsönhatását a MP holoenzim MYPT1 szabályozó alegységével felületi plazmonrezonanciás eljárással. In vitro protein kináz reakcióval, és foszfoprotein elleni antitestekkel sikerült bizonyítani a ROK általi foszforilációt a SNAP-25 Thr138-as oldalláncán. A MYPT1 alegység siRNS interferenciás csendesítésének hatására B50 neuroblasztóma sejtekben a SNAP-25 Thr138 oldallánc emelkedett foszforilációja volt megfigyelhető, mely tovább erősíti feltételezéseinket, miszerint a ROK/MP enzimpáros a felelős a SNAP-25 foszforilációs szabályozásáért. A csendesítés hatására a B50 sejtek csökkent életképességét, valamint a sejtekből készült mintákban csökkent foszfatáz aktivitást mértünk. Ezek a tények arra utalnak, hogy az idegi régiókban végbemenő sejtbiokémiai folyamatokban a PP1 enzimek hatása kiemelkedően fontos. Egér agykérgi szinaptoszóma preparátumának MP és ROK inhibitorokkal való kezelése során a SNAP-25 Thr138 oldallánc ellentétes hatású foszforilációs szintjét sikerült leírnunk, amely további eredményül szolgál az enzimpáros szerepére. Ugyanezen eredményeket sikerült egér agyszeleteken is detektálnunk immunfluoreszenciás eljárások segítségével. A SNAP-25 fehérje Thr138 foszforilációjának a SNARE-komplex kialakulására kifejtett hatását immunprecipitációs kötődési vizsgálatokkal igazoltuk. A kevésbé foszforilált SNAP-25 nagyobb mértékben kötötte a SNARE-komplex szintaxin fehérjéjét, ami arra utal, hogy az exocitózisban a MP pozitív regulátor szerepet tölthet be. Az SMTNL1 fehérjével végzett kísérletek során sikerült kidolgozni egy in vitro C2C12 mioblasztóma/miotubulus modellrendszert, melyben a krónikusan magas inzulinnal sikerült inzulinrezisztens állapotot létrehoznunk. Proteome Profiler elemzés segítségével átfogó képet kaptunk a sejteken belüli folyamatok állapotáról inzulinrezisztencia esetében, valamint SMTNL1 túltermeltetés hatására. Bizonyítottuk az SMTNL1 inzulinérzékenyítő hatását, melyet főleg a progeszteronnal együtt fejtett ki. Az inzulinérzékenyítést az inzulin receptorhoz kötődő IRS1 Ser-oldalláncok foszforilációjának csökkentése révén detektáltuk foszfospecifikus antitestekkel. A SMTNL1 további jótékony hatást fejt ki az inzulin receptor által indukált jelátviteli elemekre is, így szabályozva a PI3K, Akt, és mTOR tengelyt. Eredményeink alapján az SMTNL1 fehérje a JNK és ERK1/2 foszforilációk indirekt módon történő visszaszorításával, még inkább hozzájárul az IRS1 Ser-aminosavmaradékok foszforilációinak csökkentéséhez. Ez a JNK és ERK1/2 enzimek aktivációjáért felelős új típusú PKC csökkent expressziójával magyarázható a SMTNL1 túltermeltetés hatására. A PI3K aktivitást, és a GLUT4 expresszióját a SMTNL1 magasan tartotta még inzulinrezisztens sejtekben is. A sejtek energetikai paramétereinek mérése során kiderült, hogy a SMTNL1 az indukált inzulinrezisztenciában is magasan tartja az alap glikolízist MPA kezeléssel kombinálva. Ugyanez volt érvényes a mitokondriális aktivitás mérésekor is, ahol a SMTNL1 túltermeltetés és az MPA kezelés fokozta az ATP szintézist még inzulinrezisztens állapotban is. Mindezen eredmények az SMTNL1 inzulinrezisztenciában és ahhoz köthető rendellenességek lehetséges gyógyszerhatástani célpontja, amely fokozott expressziójával a vázizom inzulinérzékenyítését és az anyagcserefolyamatok fiziológiás irányba történő elmozdulását segítheti elő.

Our studies investigated the role of myosin phosphatase (MP) in neurotransmitter release, and SMTNL1 in insulin resistance model using C2C12 cells. Myosin phosphatase holoenzyme was first was first described in the dephosphorylation of myosin light chain (MLC20), thus enabling the regulation of smooth muscle contractility. In addition to the myosin light chain, several cytoskeletal targets have been identified such as ERM or Tau proteins. MP is composed of a PP1cδ catalytic, a regulatory/targeting MYPT1, and a M20/21 subunit. MP plays a role not only in the dephosphorylation of cytoskeletal elements. MP is expressed not only in smooth muscle cells, but also in several other tissues. Moreover, MP is playing an important role in several important cellular processes, like cell cycle regulation, neurotransmitter release, gene expression regulation by dephosphorylating several key interacting proteins. Many regulatory factors can modulate the activity MP ranging from small inhibitory molecules to interacting proteins and even MYPT1 phosphorylation via RhoA associated protein kinase (ROK) on the inhibitory regulatory side chains. Proteins that are phosphorylated by ROK are usually dephosphorylated by MP, thus the enzyme pair are counteracting each other’s effect. The interaction between SNAP-25 with MP through MYPT1 subunit was elucidated using surface plasmon resonance (SPR) experiments. In vitro protein kinase assays and phosphoprotein antibodies were used to demonstrate the phosphorylation of SNAP-25 by ROK on the Thr138 residue. Elevated phosphorylation of the SNAP-25 Thr138 side chain was observed in B50 neuroblastoma cells upon siRNA interference silencing of the MYPT1 subunit, further supporting our hypothesis that the ROK/MP enzyme couple is responsible for the phosphorylation regulation of SNAP-25. Moreover, as the result of silencing, the enzyme protein phosphatase activity, and the viability of B50 cells were decreased significantly suggesting that PP1 enzymes are the dominant protein phosphatases regulating cellular processes in neuronal cells. By treating mouse cortical synaptosomes with MP and ROK inhibitors (TMC and H1152), we were able to detect the opposite effect on the SNAP-25 Thr138 phosphorylation (TMC increased, H1152 decreased the phosphorylation) providing further evidence for the role of this enzyme couple in neuronal processes. We obtained the same results, by using immunofluorescence and confocal microscopy on synaptosomes. We managed to describe the role of this phosphorylation site in the formation of the SNARE complex with immunoprecipitation experiments. The less phosphorylated SNAP-25 bound to syntaxin with a greater extent, which indicates the positive role of MP in the process of exocytosis. Experiments with the SMTNL1 protein have led to the development of an in vitro hyperinsulinaemic/hyperglycaemic C2C12 myoblastoma/myotubule insulin resistance model. Using proteome profiler kits, we got an overview of the intracellular processes during insulin resistance, and with overexpression of SMTNL1. We demonstrated the insulin sensitizing effect of SMTNL1, mainly observed in the presence of progesterone. The insulin sensitizing effect was detected mainly with the IRS1 phospho specific antibodies, and we observed a decrease in the critical serine phosphorylation levels. SMTNL1 also shows additional beneficial effects downstream of the insulin receptor, for example the PI3K, the Akt and mTOR signaling pathways. Our data suggest that SMTNL1 further contributes to the decrease in the phosphorylation of IRS1 Ser residues by indirectly reducing JNK and ERK1/2 activity presumably via the novel PKCε isoform. SMTNL1 was able to keep the activity of PI3K and the expression GLUT4 high even in insulin resistant cells. By measuring the energetic parameters revealed that SMTNL1 overexpression combined with MPA treatment restored the basal glycolysis in insulin resistance. The same was also proved when mitochondrial activity was measured. SMTNL1 overexpression and MPA treatment enhanced ATP synthesis even in insulin resistant condition. All these findings suggest that SMTNL1 might be a potential drug target in insulin resistance and related disorders. Overexpression of SMTNL1 plays a role in maintaining normal insulin sensitivity and keeping cellular metabolic pathways at physiological levels.