A cisztás fibrózisos (CF) tüdőbetegség követésére jelenleg elérhető klinikai paraméterek korlátozott képességűek. Előzetes irodalmi adatok arra utalnak, hogy a cisztás fibrózisos tüdő epitheliális sejtjeiben fokozott a human epididymis protein 4 (HE4) expressziója. Munkacsoportunk elsőként vizsgálta a HE4 vérkoncentrációjának szerepét a CF-es légúti betegség követésében. A HE4 diagnosztikai erejének vizsgálata céljából CF-es betegek szérum HE4 koncentrációit összevetettük nem CF-es tüdőbetegek és nem tüdőbeteg egyének kontroll mintáival. A CF-es betegek esetén a HE4 értékeket korreláltattuk a FEV1%-kal és CRP értékekkel. Továbbá vizsgáltuk, hogy hogyan változik a HE4 koncentráció ivacaftor kezelés hatására, G551D mutációt hordozó CF-es betegek plazmamintáiban. In vitro vizsgálataink során pedig azt vizsgáltuk, hogy a CFTR funkció közvetlenül képes-e befolyásolni a HE4 expressziót CF-es bronchoepitheliális (CFBE) sejtkulturákban. F508del-CFTR-t, illetve vad típusú CFTR-t (wt-CFTR) expresszáló CFBE 41o- sejtek felülúszójában megmértük a HE4 koncentrációt lumacaftor/ivacaftor vagy tezacaftor/ivacaftor kezelést követően. A sejtek HE4 expresszióját CFTR aktivátor Forskolin/IBMX, valamint a CFTR működését gátló CFTRinh172 adását követően is vizsgáltuk. Ezen molekuláknak a CFTR funkcióra gyakorolt hatását a kloridáram mérése révén patch clamp technikával ellenőriztük. A HE4 expresszió változása mellett az interleukin-6 (IL-6) szintet is követtük különböző időtartamig TNF-α-val stimulált CFBE 41o- sejtekben. Az NF-κB útvonal aktiválódásának igazolására a p65 alegység nukleáris transzlokációját vizsgáltuk immunfluoreszcens mikroszkóppal, illetve immunoassay módszerrel meghatároztuk az IL-6 koncentrációt a felülúszóban az NF-κB útvonalat gátló BAY 11-7082, valamint a CFTR modulátorok jelenlétében és hiányában. Vizsgálataink során a HE4 erős diagnosztikai képessége mutatkozott, főként a CF-es és a nem tüdőbeteg egészséges kontroll összehasonlításakor. A HE4 szérumkoncentrációja szoros összefüggést mutatott a CF-es tüdőbetegség súlyosságával. Az ivacaftor kezelés szignifikánsan csökkentette a plazma HE4 koncentrációt a CF-es betegekben, ráadásul a csökkenés mértéke korrelált a légzésfunkció javulásával. In vitro vizsgálataink során a CFTR modulátorok a F508del-CFTR CFBE 41o- sejtekben részlegesen helyreállították a kóros CFTR funkciót, és ez csökkent HE4 koncentrációhoz vezetett, ami megközelítette a wt-CFTR sejtek HE4 szintjét. A CFTR inhibitor emelkedett, míg a Forskolin/IBMX csökkent HE4 expressziót váltott ki a sejtkulturákban. Az NF-κB útvonal kiindulási és TNF-α-val stimulált aktivitás szintje sokkal nagyobb mértékű volt a F508del-CFTR CFBE 41o- sejtekben a wt-CFTR sejtekhez képest. A CFTR modulátorok jelenlétében az alacsonyabb p65 nukleáris pozitivitás és IL-6 szint az NF-κB útvonal aktiválódás jelentős csökkenését jelezte. Végül a TNF-α fokozta a HE4 expressziót emelkedett IL-6 szinttel együtt, és mindkét fehérje szintje mérséklődött az NF-κB útvonal inhibitor és a CFTR modulátorok kombinált adása által. Következésképpen a HE4 vérkoncentrációja a CF-es légúti gyulladás egyik specifikus markerének mondható, mely jól korrelál a CF-es tüdőbetegség súlyosságával, és alkalmas lehet CFTR modulátor kezelések monitorozására klinikai vizsgálatokban és a mindennapi betegellátás során is. In vitro vizsgálatink alapján a CFTR diszfunkció az NF-kB útvonalon keresztül vezet fokozott HE4 termelődéshez a CFBE sejtekben.

The clinical parameters currently available for monitoring cystic fibrosis (CF) lung disease have limitations. Preliminary literature data indicated that human epididymis protein 4 (HE4) expression was increased in cystic fibrosis lung epithelial cells. Our group was the first to investigate the role of HE4 blood concentrations in the monitoring of CF airway disease. To investigate the diagnostic power of HE4, serum HE4 concentrations in CF patients were compared with non-CF lung disease patients and healthy controls. HE4 levels in CF patients were correlated with FEV1% predicted and CRP values. We also investigated how HE4 concentrations change in response to ivacaftor treatment by measuring plasma samples from CF patients carrying G551D mutation. Moreover, we investigated in vitro whether CFTR function can directly affect HE4 expression in CF bronchoepithelial (CFBE) cell cultures. We measured HE4 concentrations in the supernatants of CFBE 41o- cells expressing F508del-CFTR or wild-type CFTR (wt-CFTR) after treatment with lumacaftor/ivacaftor or tezacaftor/ivacaftor. HE4 expression in cells was also assessed after administration of the CFTR activator Forskolin/IBMX and inhibitor CFTRinh172. The effects of these molecules on CFTR function were monitored by measuring chloride current using patch clamp technique. In addition to changes in HE4 expression, we also monitored interleukin-6 (IL-6) levels in CFBE 41o- cells stimulated with TNF-α for different time periods. To confirm the activation of the NF-κB pathway, we examined the nuclear translocation of the p65 subunit by immunofluorescence microscopy and determined the IL-6 concentration by immunoassay in the supernatant of the CFBE cells in the presence and absence of CFTR modulators and BAY 11-7082, an inhibitor of the NF-κB pathway. Our study showed a strong diagnostic power of HE4, especially when comparing healthy controls with CF patients. Serum HE4 concentrations were strongly correlated with the severity of CF lung disease. Treatment with ivacaftor significantly reduced plasma HE4 concentrations in CF patients, and the extent of the decrease correlated with the improvement of the respiratory function. In our in vitro experiments, CFTR modulators partially restored abnormal CFTR function in F508del-CFTR CFBE 41o- cells, resulting in reduced HE4 concentrations that approached HE4 levels seen in wt-CFTR cells. CFTR inhibitor induced increased, whereas Forskolin/IBMX induced decreased HE4 expression in cell cultures. The baseline and TNF-α-stimulated activity levels of the NF-κB pathway were much higher in F508del-CFTR CFBE 41o- cells compared to wt-CFTR cells. In the presence of CFTR modulators, lower p65 nuclear positivity and IL-6 levels indicated a significant decrease in NF-κB pathway activation. Finally, TNF-α enhanced HE4 expression in association with elevated IL-6 levels, and both protein levels were attenuated by combined administration of NF-κB pathway inhibitor and CFTR modulators. In conclusion, HE4 may be a specific blood based marker of airway inflammation in CF that correlates well with the severity of CF lung disease and may be suitable for monitoring CFTR modulator treatments in clinical trials and in daily patient care as well. Our in vitro experiments suggest that CFTR dysfunction leads to increased HE4 production in CFBE cells via the NF-kB pathway.