Áramlási citometriás fret mérések optimalizálása és alkalmazása a majdnem teljes ErbB2 molekula modellezésében

Abstract

Munkánk két fő célja az volt, hogy fluoreszcencia rezonancia energiatranszfer (FRET) alapú epitóp térképezési és molekuláris modellezési eljárásokkal az ErbB2 receptor és dimerjének molekuláris modelljét megszerkesszük, valamint, hogy megállapítsuk újonnan kifejlesztett fluoreszkáló festékek és áramlási citométerek használhatóságát áramlási citometriás FRET (FCET) mérésekben. Vizsgálataink eredményei a következők: • Az általunk vizsgált hét fluoreszkáló festék segítségével megállapítottuk a sejtek felszínén lévő membránfehérjék asszociációjának áramlási citometriás tanulmányozásához nélkülözhetetlen paramétereket, melyek a normalizált fluoreszcencia intenzitás, a transzfer átmenet nagyságára jellemző átfedési integrál (vagy kritikus Förster távolság), a normalizált FRET hatékonyság, valamint a festékek gerjeszthetőségét figyelembe vevő efr együttható. • Az általunk vizsgált három áramlási citométeren azt találtuk, hogy a FCET mérésekhez az Alexa546-Alexa647 és az Alexa555-Cy5 donor-akceptor festékpár optimális. • FCET mérésekben meghatároztuk az ErbB2 receptor különböző epitópjaihoz kötődő, fluoreszkáló festékekkel jelzett antitestek egymástól és a sejtmembrántól való távolságait. • A fenti távolság és irodalmi kristályszerkezeti adatok alapján, molekulamodellezési eljárások segítségével megszerkesztettük a majdnem teljes ErbB2 transzmembrán receptor molekuláris modelljét, amely tartalmazta az extracelluláris domént, a transzmembrán régiót és a tirozinkináz domént, valamint az ezeket összekötő szakaszokat. Az antitesttel jelölt ErbB2 molekulák között mért FRET hatékonyság értékek alapján felállítottunk egy lehetséges modellt az ErbB2 receptor dimerre, amely az EGFR dimerhez hasonló módon kapcsolódott össze, valamint rámutattunk több lehetséges dimerizációs felszínre a külső membránközeli összekötő szakasznál, a transzmembrán, valamint a tirozinkináz régióknál.