Foszfo-Ser/Thr-specifikus fehérje foszfatázok szerepe az in vitro porcdifferenciáció szabályozásában

Abstract

Kísérleteink során a két fő celluláris foszfo-Ser/Thr-specifikus protein foszfatáz, a PP1 és a PP2A, valamint a cAMP dependens protein kináz (PKA) szerepét vizsgáltuk az in vitro porcdifferenciáció szabályozásában specifikus foszfatáz és kináz inhibítorok alkalmazásával. Munkánk eredményeit az alábbiakban foglaljuk össze:

Elsőként alkalmaztuk a foszfatáz inhibítor okadainsavat (OA) egy normál differenciálódó sejtkultúrában és a porcképződés fokozódását tapasztaltuk. A keletkezett porc morfológiai és biokémiai elemzésével bebizonyítottuk, hogy nem tumoros burjánzást indukáltunk, hanem a normál porcdifferenciációt fokozta az OA. Kimutattuk, hogy a porcdifferenciáció során a PP1 aktivitása közel állandó és magas értéken van, míg a PP2A aktivitása a folyamat előrehaladtával párhuzamosan csökken. Az OA-t nM-os koncentrációkban adva, a PP2A aktivitás csökkenését láttuk, míg a PP1 aktivitása nem változott. Az OA-t az enzimaktivitási mérések során alkalmazva, az semmilyen hatást nem fejtett ki a PKA aktivitásra. Az OA fokozta a sejtproliferációt. H89 adásával gátolva a PKA aktivitását, a porcképződést dózisfüggő módon gátoltuk. A H89 erőteljesen csökkentette a sejtproliferációt is. A tenyészeteket OA-val kezelve emelkedett a PKA aktivitása, így arra következtettünk, hogy a high density kultúrákban zajló porcdifferenciáció során a PP2A defoszforilálhatja a PKA katalitikus alegységét. A PKA katalitikus alegység expressziója sem OA, sem H89 hatására nem változott számottevő mértékben. A H89 és OA kezelést együtt alkalmazva az alacsony szintű PKA aktivitás fokozódott. Az OA serkentette a H89-cel gátolt porcképződést, de nem emelte a H89-cel kezelt kultúrák alacsony proliferációs rátáját. Ezért feltételezzük, hogy a PKA mediálta jelátviteli út mellett egyéb PP2A által modulált folyamatok is részt vesznek a sejtproliferáció szabályozásában a kondrogenezis során. A H89 csökkentette, az OA pedig fokozta a CREB foszforilációját, így bizonyítottnak látjuk, hogy az in vitro porcdifferenciáció során a PKA és a PP2A részt vesznek a fenti transzkripciós faktor reverzibilis foszforilációjában. Eredményeink alapján feltételezzük, hogy a CREB egyike azon transzkripciós faktoroknak, amelyek a porcképződést szabályozzák.