A Claviceps paspali indol-diterpén bioszintézisének vizsgálata Agrobacterium tumefaciens segítségével végzett transzformáción alapuló génkiütéssel

Kozák, László

A Claviceps paspali indol-diterpén bioszintézisének vizsgálata Agrobacterium tumefaciens segítségével végzett transzformáción alapuló génkiütéssel

dc.contributor.advisor	Pócsi, István
dc.contributor.author	Kozák, László
dc.contributor.authorvariant	Kozák, László
dc.contributor.department	Gyógyszertudományok doktori iskola	hu
dc.contributor.submitterdep	DE--Természettudományi és Technológiai Kar -- Molekuláris Biotechnológiai és Mikrobiológiai Tanszék
dc.date.accessioned	2021-06-16T16:04:54Z
dc.date.available	2021-06-16T16:04:54Z
dc.date.created	2021	hu_HU
dc.date.defended	2021-06-24
dc.description.abstract	A C. paspali egy növényparazita Ascomycota törzsbéli gomba, amely Paspalum fűfélékkel való együttélésekor nagy mennyiségben állít elő IDT típusú mikotoxinokat. Abból kifolyólag, hogy a P. dilatatum – a C. paspali elsődleges gazdanövénye – egy igen elterjedt takarmánynövény a déli féltekén, az ilyen típusú mérgezések jelentős károkokat okoznak az állattenyésztési szektorban minden évben. Ugyanakkor a C. paspalit a gyógyszeriparban előszeretettel alkalmazzák azon tulajdonsága miatt, hogy axenikus körülmények között nagy hozamban képes vízoldható ergot alkaloid származékokat előállítani. Ezek tekintetében meglepő, hogy ez idáig senki sem vizsgálta, hogy a C. paspali fermentációs körülmények között képesképes-előállítani IDT típusú mikotoxinokat. Továbbá munkánk megjelenéséig nem dolgoztak ki olyan genetikai transzformációs módszert, amellyel hatékonyan lehetne elvégezni a kívánt genetikai módosításokat ezen a gombán. Ennek következtében, sem az ergot alkaloid, sem pedig az IDT bioszintetikus génklaszterek kísérletes igazolása nem történt meg ebben a gombában. Munkám során elsőként igazoltam azt, hogy a C. paspali axenikus körülmények között képes előállítani IDT típusú mikotoxinokat. Annak érdekében, hogy kísérletesen is tudjuk igazolni a feltételezett IDT génklaszter funkcióját a C. paspaliban, kifejlesztettünk egy A. tumefaciens segítette géntranszferen alapuló stabil transzformációs rendszert erre a gombára. Az általunk kifejlesztett transzformációs módszer segítségével sikeresen inaktiváltuk az paszpalitrem génklaszter egy részét, ami az IDT bioszintézis teljes blokkolását eredményezte a vizsgált gén-kiütött transzformánsokban. Az ATMT módszert felhasználva kísérletesen igazoltuk a klaszter két génjének, az idtP (P450 monooxigenáz) és idtF (monoprenil transzferáz) géneknek a funkcióját. Mind a két gén inaktiválása a paszpalitrem típusú IDT-ek eliminálásához vezetett, miközben a ∆idtP mutánsok esetében a paszpalin, az ∆idtF mutánsok esetében a paszpalinin jelent meg fő termékként. Az általunk elvégzett kísérletek új lehetőségeket nyitnak meg a C. paspali genetikájában. Az optimalizált transzformációs protokoll segítségével lehetőség nyílik olyan ipari izolátumok létrehozására, amelyek képesek nagyobb mértékben, vagy módosított spektrummal előállítani az ergot alkaloid metabolitokat. Továbbá célzott genetikai módosítások révén a C. paspali IDT bioszintézise olyan irányba módosítható, hogy a bioszintetikus folyamat végterméke csökkent toxicitást mutasson emlősökre nézve, de megtartsa toxicitását a kártevő rovarokkal szemben, lehetővé téve ezzel a gomba és az általa termelt IDT-ek felhasználhatóságát a rovarkártevők kontrolljában. Functional validation of the C. paspali IDT gene cluster allowed us to construct a model for paspalitrem biosynthesis. The protein products of the idtG, idtM, idtB and idtC genes in the paspalitrem cluster show 53, 38, 56 and 45% identity, respectively, with the protein products of the paxG (geranylgeranyl diphosphate [GGPP] synthase), paxM (FAD-dependent monooxygenase), paxB (IDT cyclase) and paxC ( prenyl transferase) genes of the paxilline gene cluster in P. paxilli, which catalyse the assembly of paspaline, the first stable cyclic IDT compound. Therefore, it can be hypothesized that similarly, the IdtG, IdtM, IdtB, and IdtC proteins of C. paspali catalyse the early steps of paspalitrem biosynthesis, resulting in the formation of paspalin. The idtP and idtQ genes of the paspalitrem gene cluster encode two cytochrome P450 monooxygenase enzymes. The idtP gene product shows 41% identity to PaxP of P. paxilli. We propose that just as PaxP, IdtP catalyses the conversion of paspaline to 13-desoxypaxilline via the intermediate β-PC-M6 by removing the C-30 methyl group and installing the carbonyl oxygen at C-10. The amino acid sequence of IdtQ shows 37% similarity with the amino acid sequence of PaxQ (P450 monooxygenase in paxilline biosynthesis). The role of the IdtQ is dual. First, it catalyses the C-13 oxidation of 13-desoxypaxilline, resulting paxilline. Second, it also mediates the C-7 oxidation of paxilline, which affords paspalinine. Considering that both paspalicine and paxilline were detected in the C. paspali—P. dilatatum association, it is reasonable to assume that IdtQ does in fact catalyse both the C-13 and the C-7 oxidations of 13-desoxypaxilline. Whether paxilline may be converted to paspalinine by IdtQ, or paxilline represents a shunt product of the pathway remains to be determined. The next step of paspalitrem biosynthesis is the installation of the 2-methylbut-2-ene side chain to the C-21 or C-20 carbons, resulting in paspalitrem A or paspalitrem C, respectively. The most likely candidate for the prenylation reaction is the IdtF prenyl transferase, which shows 21% identity with the AtmD enzyme of Aspergillus flavus. Accordingly, no prenylated IDT derivatives were present in the extracts of the ∆idtF strains we generated, but an accumulation of paspalinin was observed, clearly demonstrating that IdtF is responsible for the prenylation of paspalinin in paspalitrem biosynthesis. The final step of the paspalitrem biosynthesis is the hydroxylation of the prenyl side chain at C-32 by a still unknown oxidase to afford paspalitrem B.	hu_HU
dc.format.extent	128	hu_HU
dc.identifier.uri	http://hdl.handle.net/2437/311199
dc.language.iso	hu	hu_HU
dc.subject	Claviceps paspali	hu_HU
dc.subject	Agrobacterium tumefaciens
dc.subject	indol-diterpén
dc.subject	paszpalitrem
dc.subject	lizergsav
dc.subject	ergot
dc.subject	paszpalum tántorgás
dc.subject	Claviceps paspali
dc.subject	Agrobacterium tumefaciens
dc.subject	indole-diterpene
dc.subject	paspalitrem
dc.subject	lysergic-acid
dc.subject	paspalum stagger
dc.subject.discipline	Gyógyszertudományok	hu
dc.subject.sciencefield	Orvostudományok	hu
dc.title	A Claviceps paspali indol-diterpén bioszintézisének vizsgálata Agrobacterium tumefaciens segítségével végzett transzformáción alapuló génkiütéssel	hu_HU
dc.title.translated	Examination of the indole-diterpene biosynthesis of Claviceps paspali by Agrobacterium tumefaciens mediated gene knock out studies	hu_HU