Rizs protein foszfatáz 2 A B'' (PP2A B”) alegységének termeltetése baktériumban

Abstract

A protein foszfatáz 2A (PP2A) fontos szerepet játszik az állatok sejtciklusának regulációjában, többek között a retinoblasztóma fehérjék foszforilációs állapotát is szabályozza. A PP2A és a retinoblasztóma-fehérjék homológjai növényekben is megtalálhatók, de funkciójuk sokkal kevésbé ismert, mint az állatokban. A PP2A változó B regulátor alegységei meghatározzák a foszfatáz sejten belüli lokalizációját és szubsztrátspecificitását. A Szegedi Biológiai Központban végzett kísérlet szerint a lucerna PP2A B” alegysége élesztő kéthibrid-rendszerben kölcsönhatásba lép az OsRBR1 retinoblasztóma-homológ rizs fehérjével, így a B” alegységet tartalmazó növényi PP2A holoenzimnek in vivo is szerepe lehet az OsRBR1 defoszforilációjában. Ennek tanulmányozása érdekében a rizs PP2A B” alegységet hexahisztidin-fúziós fehérjeként expresszáltuk E. coli baktériumban, majd Ni2+-agaróz kromatográfiával homogén formában tisztítottuk. A rekombináns fehérje ellen poliklonális ellenanyagot termeltettünk nyúlban. Az antiszérumot affinitás-kromatográfiával tisztítottuk. Az ellenanyagot dot blottal és Western blottal vizsgáltuk. Eredményeink szerint a PP2A B” antitest nemcsak a rekombináns His6-PP2A B” fehérjét ismeri fel, hanem – a Western blottal azonosított protein molekulatömege alapján) a rizs szuszpenziós sejtkivonatban és a levélkivonatban levő PP2A B” fehérjét is. Ennek alapján a továbbiakban felhasználhatjuk az ellenanyagot többek között a PP2A-val kölcsönható fehérjék azonosítására immunprecipitációs kísérletekben.