Korábbi vizsgálatokban a HIV-1 kapszid fehérjét a virális proteáz szubsztrátjaként azonosították in vitro. Mivel a proteáz része a sejtbe bejutó magi struktúrának feltételezhetően szerepet játszik a fertőzés korai fázisában is, például a kapszid monomerek hasítása révén. Munkánk során a kapszid fehérjében azonosított hasítóhelyeken olyan mutációkat (W23A, A77P, A78V, L189F, L189I és L189P) hoztunk létre, amelyek a proteázon korábban végzett specificitás vizsgálatok eredményei alapján megváltoztatják a kapszid fehérje virális proteáz általi hasíthatóságát, ezáltal a későbbiekben eszközként szolgálhatnak a proteáz korai fázisban betöltött szerepének alaposabb vizsgálatához. A létrehozott mutáns kapszid fehérjék szerkezetében bekövetkező változásokat in silico becsültük meg, amelyet CD-spektroszkópia alkalmazásával támasztottunk alá. A fehérjék proteolízissel szembeni érzékenységét HIV-1 PR és tripszin által létrehozott hasítási termékek analízisével határoztuk meg. Eredményeink alapján elmondhatjuk, hogy az elsődleges hasítási helyekhez tartozó aminosavak mutációja általában nem csak a kapszid fehérje proteáz általi hasíthatóságát változtatja meg, hanem esetenként annak másodlagos szerkezetét és CypA kötő képességét is. Jóllehet a W23A, A77P és L189P mutációk sikeresen módosítják a proteáz általi hasítást, másodlagos szerkezetük is jelentősen megváltozik, ezáltal nem alkalmasak a célkitűzésben megfogalmazott céljainkra. Mutánsaink közül egyedül az L189F tűnik szerkezetében változatlannak a vad típushoz viszonyítva, ezáltal ez lehet a legalkalmasabb jelölt a PR általi CA hasítás korai fázisban betöltött szerepének további vizsgálatára sejtkultúrás körülmények között. A HIV-1, valamint a génterápiás célokra kifejlesztett HIV-alapú vektorok replikációja nagymértékben függ a gazdasejt saját fehérjéitől. A közelmúltban végzett kísérletek eredményeképpen több száz olyan gazdasejt fehérjét kódoló gén került kimutatásra, amelyek expressziójának változása szintén a vírusfertőzéssel hozható kapcsolatba. Ezen gének termékeinek közvetlen vizsgálata segíthet tisztázni azok pontos szerepét, így egy több géntermékre kiterjesztett proteomikai vizsgálat segíthet leszűkíteni a vizsgálandó célpontok körét. Munkánk során egy HIV-1 alapú vektorrendszer felhasználásával 293T sejtekben vizsgáltuk a pszeudovírus által okozott gazdafehérje expresszióban bekövetkező változásokat jelölés nélküli („label-free”) kvantitálás segítségével. Kísérletünk eredményeképpen sikerült azonosítanunk 25 olyan fehérjét, amelynek expressziója valamilyen irányban megváltozik a HIV-1 pszeudovírussal transzdukált sejtekben a transzdukció után 4, illetve 12 órával. Az azonosított fehérjék irodalmának vizsgálata alapján összefoglalásként elmondhatjuk, hogy a jelölés nélküli kvantitálás alkalmas módszer a sejtben bekövetkező változások nyomon követésére, ugyanis a fehérjék többségét korábban is összefüggésbe hozták a HIV-1 életciklusával. Sajnos azonban néhányuk kivételével pontos szerepük a folyamatban továbbra sem tisztázott. Véleményünk szerint a vizsgálatunk során azonosított fehérjék megfelelő célpontokat kínálhatnak a HIV-1- gazdasejt kapcsolatának vizsgálatához, amely segítséget nyújthat új, hatékonyabb antivirális terápiák kifejlesztéséhez.

In previous studies, capsid protein of the HIV-1 have also been found to be a substrate for the viral protease in vitro. As the protease is part of the viral core which is entering the cell, it might contribute to the viral infectivity by the processing of capsid monomers. Based on previous specificity studies of the viral protease we have introduced mutations to the cleavage sites of HIV-1 capsid protein (W23A, A77P, A78V, L189F, L189I és L189P) which can alter its proteolytic susceptibility. In this work, we have predicted the changes generated by the introduced mutations with in silico analysis. The results of the predictions were verified by CD-spectroscopy analysis and the proteolytic susceptibility of the proteins was determined by the analysis of the proteolytic fragments. We concluded, that mutations of the capsid cleavage sites not only affect the proteolytic susceptibility to the HIV-1 protease, but may also substantially alter the secondary structure, tryptic susceptibility and cyclophilin A binding ability of the monomeric capsid protein. Although the W23A, A77P, and L189P mutations were able to modify the cleavage of the capsid by HIV-1 protease, due to the observed structural alterations, they were not suitable for our goal. Our experiments also showed that only the L189F mutant protein remains structurally unchanged, hence, it could be the best candidate for use in experiments regarding the role of HIV-1 protease in the early phase of HIV-1 infection. Replication of HIV-1 and HIV-based gene therapy vectors are highly depends on the proteins of the host cell machinery. Hundreds of genes involved in viral transduction were identified recently. A proteomic study extended to several gene products can narrow down the number of targets to be examined. Our goal was to identify host proteins which are possibly involved in the regulation of the early events of pseudovirus transduction, with the utilization of an HIV-1 pseudovirus and label-free proteomics. In this study, with the utilization of an HIV-1 pseudovirus and label-free proteomics we have identified 25 host proteins, which showed significant alterations in their expression level 4 and/or 12 hours after transduction. Review of the literature regarding the interaction and role of these proteins to the HIV-1 life cycle showed that with only one exception, these proteins were already verified as possible factors in the HIV-1 replication, however, in most cases, their exact role is still not clarified. Based on these data, we concluded that label-free proteomics is a capable method for the investigation of proteomic changes during HIV-1 replication. Moreover, we think that the thorough examination of the identified proteins presented here would give us more information regarding the host players and signaling pathways of HIV replication, eventually leading to the possibility of the development of new and more effective antiviral therapies.