Az alacsony onkogén kockázatú HPV6 és 11 etiológiai szerepe már bizonyított számos benignus megbetegedés, köztük a rekurrens légúti papillomatózisok kialakulásában, azonban a kórképek súlyossága és a vírus genetikai jellemzői közötti összefüggések még kevésbé ismertek. Azonban egyre inkább ismert az, hogy a magas és alacsony onkogén kockázatú HPV genotípusok alapvető különbségeket mutatnak az okozott betegség kórlefolyásában és az annak hátterében álló genetikai variabilitás tekintetében. A munkánk során célunk új páciensektől, valamint már ismert betegek új recidívájából származó HPV6 és HPV11 szekvenciák teljes genom analízise volt. In silico protein modellezéssel vizsgáltuk az aminosavcserék potenciális hatását a vírusfehérjék szerkezetére és a fehérjék funkciójára. Tranziens transzfekciós kísérletekben elvégeztük a különböző LCR mintázatok funkcionális vizsgálatát, valamint elemeztük az E2 fehérje variánsainak hatását az LCR aktivitására. A HPV6 genomjaink a filogenetikai elemzés alapján az A fő-, valamint a B1 és B3 alvonalba tartoztak, leggyakoribbnak a B1 alvonal bizonyult. A szekvencia elemzések eredményei alapján a HPV6B1 alcsoportba tartozó szekvenciák ORF-jei esetében a nukleotidcserék többször eredményeztek aminosavcserét is, mint az A vonalba sorolható HPV6 genomok esetén. Ezzel szemben a LCR-t tekintve az HPV6A szekvenciái bizonyultak variábilisabbnak. Az HPV6 LCR funkcionális vizsgálata során a variánsok LCR aktivitásának gradiens-szerűen csökkenését tapasztaltuk; legmagasabb a HPV6A vonal transzkripciót aktiváló képessége, melyet a B1 és végül a B3 filogenetikai alcsoport LCR aktivitása követ. Ez alátámasztja azt a hipotézist, hogy különbség van az egyes HPV6 (al)csoportok sejtproliferációt moduláló hatása között. A B1 alcsoporttal szemben a HPV6A filogenetikai vonal esetében inkább az LCR transzkripciót aktiváló hatása érvényesül. A HPV6A vonalban azonosított transzkripciós faktor kötőhelyek nagyobb variabilitása is ezt támaszthatja alá. A HPV11 esetében az ORF-ek és az LCR is számos polimorfizmust tartalmaz a referencia szekvenciához viszonyítva. A filogenetikai vizsgálatok alapján az A2 alvonal dominanciája volt megfigyelhető. A szekvencia vizsgálatok alapján az E1, E2/E4 és E5a, valamint a kapszid proteineket kódoló régiók és az LCR esetében nagyobb variabilitás figyelhető meg. Az E2 ORF-ben azonosított K308R aminosavcsere E2 dimerben erős kötést alakít ki a stabilizáló láncok között, de nem befolyásolja a DNS-kötést, amely következtében ez az E2 variáns kevésbé hatékony enhanszer aktivitással rendelkezik, mint a referencia E2. Az egyedi Q86K aminosavcsere a fehérje felszíni töltését változtatja meg. A két, a fehérje hinge-régiójában található szintén egyedi aminosaveltérés (S245F és N247T) a foszforilációs mintázatban okoz változást. Az E2/E4 ORF régióban azonosított 58 bp deléció leolvasási kereteltolódást és korai stop kodon kialakulását eredményezi, amely valószínűleg működésképtelen E2 fehérjét hoz létre; az E2 funkció kiesése pedig hozzájárulhatott a diszpláziával járó papillomatózis kialakulásához. Az LCR és E2 kotranszfekciós vizsgálata megerősíti, hogy az LCR valódi transzaktiváló hatása és az E2 enhanszer hatására történő LCR aktivitás fokozódása együttesen befolyásolják az LCR nettó hatását. Eredményeink alapján tehát úgy tűnik, hogy az alacsony onkogén kockázatú genotípusok intratípusos variánsainak esetében is - hasonlóan a magas onkogén kockázatú genotípusokhoz – azonosíthatóak olyan vírusgenetikai különbségek, amelyek eltéréseket okoznak a vírusvariáns patogenitásában/virulenciájában a referenciához képest, de ezen eltérések hátterében nem a fő onkoproteineket, hanem sokkal inkább az E1, E2/E4 és E5a, valamint a kapszid proteinek és az LCR variabilitása állhat.

The etiological role of low-risk HPV6 and 11 has been demonstrated in the development of many benign diseases, including recurrent respiratory papillomatosis, but the association between disease severity and genetic characteristics of the causative agents is even less well known. However, it is also increasingly known that HPV genotypes with high and low oncogenic potential show basic differences in the course of the disease caused and in the underlying genetic variability. The aim of our work was to perform the complete genome and phylogenetic analysis of HPV6 and HPV11 from newly enrolled patients as well as new recurrences from already known patients. The potential effect of amino acid changes on the structure and function of viral proteins was also investigated by in silico protein modelling. In transient transfection experiments, we performed functional analysis of different LCR patterns and examined the effect of E2 protein variants on LCR activity. Based on the phylogenetic analysis of HPV6 genomes, our sequences belonged to the lineage A and to the sublineages B1 and B2; sequences belonging to the sublineage B1 were the most common. The results of the sequence analysis showed that nucleotide substitutions in HPV6 sublineage B1 sequences resulted in amino acid changes more frequently than those of HPV6 genomes classified as lineage A. In contrast, in case of lineage A sequences the LCRs showed higher variability. In the functional analysis of the HPV6 LCRs, a gradient-like decrease in the LCR activity of the variants was observed; the highest activity was related to the HPV6 lineage A variants, followed by the LCR activity of the phylogenetic sublineages B1 and finally B3. These results support the hypothesis that there is a difference among the effect of each HPV6 (sub)lineages in the modulation of the cell proliferation. In contrast to sublineage B1, the lineage A LCR has more efficient transcription activating effect. The greater variability of the transcription factor binding sites identified in the HPV6A lineage may also support this. In case of HPV11 genotype, both the ORFs and the LCR contain many polymorphisms in comparison to the reference sequence; greater variability was observed for E1, E2/E4, and E5a as well as regions encoding capsid proteins and the LCR. Based on the phylogenetic analysis, the dominance of the sublineage A2 was detected among our HPV11 sequences. The K308R amino acid change identified in the E2 ORF is capable of forming strong interaction between the stabilizing chains in E2 dimers but does not influence the DNA binding, resulting in this E2 variant with less efficient enhancer activity than the reference E2. The unique amino acid alteration Q86K changed the negative surface charge of E2 (Q86) to positive (K86). The unique alterations S245F and N247T in the hinge region of the protein cause changes in the phosphorylation pattern. The 58 bp long deletion identified in the E2/E4 ORF results in a frameshift and the formation of an early stop codon, which lead to the formation of truncated and non-functional E2 protein; the loss of E2 function may have contributed to the development of papillomatosis with dysplasia. Co-transfection experiments with different LCR and E2 combinations confirm that the basic transcription activating effect of the LCR and the enhancer activity of the E2 protein together determine the gross transactivating effect of the LCR. In conclusion, based on our results, it appears that in case of intratypic variants of low-risk HPV genotypes - similarly to high-risk ones – such genetic changes can be identified which can cause differences in the pathogenicity/virulence of the virus variants. In the background of these differences rather the variability of the E1, E2/E4, and E5a, as well as capsid proteins and LCR may be identified than the variation of the main oncoproteins.