A precíziós onkológia korszakában nagyon fontossá vált a beteg daganatára egyedileg jellemző specifikus eltérések azonosítása, mely igen érzékeny tecnikákat, nagy áteresztőképességű módszereket igényel. A daganatok patológiájának megismeréséhez elengedhetetlen a szöveti biopsziák megfelelő vizsgálata, amely azonban sok esetben nehézségekbe ütközik. Egyre nagyobb a törekvés a liquid biopszia (LB) klinikai döntéshozatalba való alkalmazásának bevezetésére, hiszen a betegek perifériás vére a tumorból származó szabad keringő nukleinsavakat tartalmazza. Éppen ezért munkánk célja két a rutin diagnosztikában megfelelő gyakorisággal előforduló daganattípus vizsgálata volt, ahol teszteltük a szöveti és liquid biopsziát mint különböző mintatípust, valamint az újgenerációs szekvenálást és a digitális PCR-t, mint nagy áteresztőképességű érzékeny technológiát. Az epeúti daganatok ritka és rossz prognózissal járó malignitások, melyek kezelési lehetősége, most sem tisztázott teljes mértékben. Az anatómiai lokalizáció alapján elkülönülő csoportokat ugyanolyan módon kezelik, pedig bizonyított, hogy eltérő molekuláris mintázattal rendelkeznek. A primer cutan melanoma pedig a bőr daganatos elváltozásainak csaknem 1 %-át teszi ki, azonban számos távoli áttétet képezhet, illetve nagyon magas mortalitás jellemzi. A melanomás betegek nagy számban BRAF mutációt hordoznak, ezen belül is leggyakrabban a BRAF c.1799T>A; p.Val600Glu aminosavcserével járó eltérést melyre specifikus onkoterápiás szerek állnak rendelkezésünkre. Ezen ismeretek tudatában mindkét daganattípus hátterének minél korábbi tisztázása létfontoságú. Célunk igazolni a LB használhatóságát cholangiocarcinomás minták esetén a becsült tumorméret és a szabad nukleinsav koncentrációja közötti összefüggés vizsgálatának segítségével. Mindezek mellett a szomatikus mutációkat újgenerációs szekvenálás alkalmazásával mutatjuk ki, a kapott eltérések alapján megtörténik a variáns tumorterhelés számszerűsítése és összehasonlítása az egyes epeúti daganattípusok között. A digitális PCR használatával egyszerre csak egy genetikai eltérés vizsgálatható. A cutan melanomás betegeknél, így a leggyakoribb genetikai eltérésre alkalmaztunk próbát. Elsőként retrospektív módon igazoltuk a módszer hatékonyságát a mutáció kimutatására, száz korábban reverz hibridizáción alapuló módszerrel kimutatott ismert BRAF státuszú kórszövettani mintát (FFPE blokk) választottunk ki, akiknél ugyanazon szövetből digitális PCR-al is elvégeztük a BRAF státuszának meghatározosát. Ezen túlmenően prospektív módon 34 beteg esetében mindkét mintatípusnál (kórszövettani és LB) mind StripAssay-t, mind pedig digitális PCR vizsgálatot is végeztünk.
Munkánk során a cholangiocarcinomás esetekben a LB használatával pozitív korrelációt találtunk a becsült tumortérfogat és a cfDNS-hozam között. Mutációkat 31/38 betegnél (81,6%) azonosítottunk, öt esetben csak a LB minta volt informatív. A patogén mutációk, mint például az FGFR2, IDH1, IDH2, KRAS és TP53 azonosíthatók voltak mindkét mintatípusban. Cutan melanomák esetében pozitív korrelációt találtunk az összes esetben a Breslow mélység és a cell-free DNS mennyisége között (cfDNS), valamint a szöveti mutációk VAF-ja (tdVAF) és a LB-ből kimutatott mutációk VAF-ja (cfVAF) között. Hasonló párhuzamot figyeltünk meg a mutáns csoportban a szöveti DNS mennyiség (tdDNS) és a tdVAF között, továbbá a cfDNS és a cfVAF értékek is korreláltak egymással. Megfigyeltük továbbá, hogy a Clark V-ös kategóriába tartozó daganatok esetében magasabb volt mind a cfDNS koncentrációja, mind a cfDNS VAF-ja és tdVAF-ja is. Igazoltuk, hogy az előrehaladottabb stádiumú betegek perifériás vére nagyobb mennyiségű tumorból származó DNS-t tartalmaz. Tanulmányaink során klinikailag releváns pontmutációkat mutattunk ki epeúti tumorok mind szövettani, mind liquid biopsziás mintáiból, illetve sikeresen igazoltuk a LB alkalmazhatóságát primer cutan melanomával diagnosztizált betegek esetében is.

In the era of precision oncology, the identification of tumor-specific alterations unique to each patient has become increasingly important, requiring highly sensitive and high-throughput analytical methods. Understanding tumor pathology is essential for accurate diagnosis and relies on the proper examination of tissue biopsies, which, however, often presents significant challenges. Therefore, there is a growing effort to introduce liquid biopsy (LB) into clinical decision-making, since the peripheral blood of patients contains tumor-derived circulating nucleic acids. Our study aimed to investigate two tumor types that occur with sufficient frequency in routine diagnostics, testing tissue and liquid biopsies as different sample types, and comparing next-generation sequencing (NGS) and digital PCR (dPCR) as high-throughput, sensitive technologies. Cholangiocarcinomas are rare malignancies with poor prognosis, and their therapeutic options remain incompletely defined. Although they are classified based on anatomical localization, these subgroups are often treated similarly, despite evidence showing that they possess distinct molecular profiles. Primary cutaneous melanoma accounts for approximately 1% of all malignant skin tumors, yet it has a high metastatic potential and mortality rate. A large proportion of melanoma patients carry BRAF mutations, most commonly the BRAF c.1799T>A; p.Val600Glu substitution, for which specific targeted therapies are available. In light of these facts, the early clarification of the molecular background in both tumor types is of crucial importance. Our goal was to verify the applicability of liquid biopsy in cholangiocarcinoma samples by examining the correlation between estimated tumor size and the concentration of circulating nucleic acids. In addition, somatic mutations were identified using next-generation sequencing, and based on the detected alterations, variant tumor burden was quantified and compared across the different subtypes of biliary tract cancers. Using digital PCR, only one genetic alteration can be analyzed at a time; therefore, in cutaneous melanoma patients, we focused on the most frequent mutation. First, we retrospectively validated the efficiency of the method for mutation detection. We selected 100 histopathological samples with previously known BRAF status, determined by a reverse-hybridization–based assay, and re-analyzed them using digital PCR to determine the BRAF status in the same tissues. Furthermore, in a prospective cohort of 34 patients, both sample types (tissue and LB) were tested using both StripAssay and digital PCR methods. In our study, a positive correlation was found between estimated tumor volume and cfDNA yield in cholangiocarcinoma cases using LB. Mutations were identified in 31 out of 38 patients (81.6%), with five cases where only the LB sample was informative. Pathogenic mutations, such as those in FGFR2, IDH1, IDH2, KRAS, and TP53, were identified in both sample types. In cutaneous melanomas, a positive correlation was observed in all cases between Breslow depth and the amount of cell-free DNA (cfDNA), as well as between the variant allele frequencies (VAF) of tissue mutations (tdVAF) and those detected in LB (cfVAF). A similar relationship was found in the mutant group between tissue DNA (tdDNA) and tdVAF, while cfDNA and cfVAF values also showed significant correlation. Additionally, Clark level V tumors exhibited higher cfDNA concentrations, cfDNA VAF, and tdVAF values. We confirmed that patients with more advanced disease stages had higher levels of tumor-derived DNA in their peripheral blood. In summary, our study identified clinically relevant point mutations in both histological and liquid biopsy samples from biliary tract tumors, and successfully demonstrated the applicability of liquid biopsy in patients diagnosed with primary cutaneous melanoma.