Bioprotekcióra alkalmas élesztőgomba izolátumok antagonista hatásának vizsgálata és genetikai elemzése

Dátum
Szerzők
Horváth, Enikő
Folyóirat címe
Folyóirat ISSN
Kötet címe (évfolyam száma)
Kiadó
Absztrakt
A munkánk során egyik célunk antagonista hatással rendelkező élesztőgomba izolátumok felkutatása és azok identifikálása volt. A Botrytis cinerea postharvest patogén gombával szemben elvégzett kísérletek eredményeként elmondható, hogy több általunk tesztelt élesztőgomba is képes volt a fonalas gomba gátlására. A leghatásosabbnak a pigmenttermelő Metschnikowia izolátumok bizonyultak, melyek körül széles, teljesen feltisztult gátló zóna alakult ki. Ezen élesztőgombák DNS alapú azonosításakor szembesültünk azzal a problémával, hogy a genomból közvetlenül szekvenált 26S riboszómális RNS-t kódoló DNS D1/D2 régió kétes nukleotidokat tartalmaz mind a három vizsgált izolátumban. A többszörös szekvenciaillesztést követően kiderült, hogy a bizonytalan nukleotidok ugyanabban a pozíciókban találhatóak meg a fajcsoport típustörzseiben is. A jelenséget a csoporton belül a Metschnikowia fructicola és Metschnikowia andauensis fajoknál korábban már leírták. Mi kimutattuk, hogy ez előfordul a fajcsoport többi tagjában is. Ezért a vizsgálatokat kiterjesztettük az ITS1-5,8S-ITS2 régióra is. Azt találtuk, hogy a D1/D2 doménhez hasonlóan mindkét faj ITS régiójában kétes nukleotidok találhatóak, amikor a szakaszt közvetlenül a genomokból szekvenáltuk. A probléma feloldása érdekében véletlenszerűen klónoztunk az amplifikált DNS-készítményből. Az összes M. andauensis és a legtöbb M. fructicola klón egyedi szekvenciákkal rendelkezett. A feltárt polimorfizmus nem tulajdonítható szekvenálási hibának, mivel a variábilis helyek nem véletlenszerűen szétszórtan helyezkednek el a klónozott régiókban. Együtt nézve az intragenomikus D1/D2 diverzitást az ebben a tanulmányban feltárt ITS-diverzitással azt a következtetést vonhatjuk le, hogy a riboszómális RNS-t kódoló DNS alapú szekvenálás nem használható a M. andauensis és a M. fructicola egymástól, és a rokon fajoktól való taxonómiai elkülönítésére. Figyelembe véve a kimutatott magas intragenomikus diverzitást, az összes korábbi törzset, melyet e fajok egyikével azonosítottak taxonómiai szempontból újra kell vizsgálni. Az élesztőgomba mezőgazdasági kultúrákban történő alkalmazása szempontjából fontos, hogy milyen tényezők befolyásolják antagonista mechanizmusuk kifejeződését. Ezért dolgozatunk másik célja volt többet megtudni arról, hogy az élesztőgombák antagonista hatását a tenyésztési körülmények milyen mértékben befolyásolják. A Metschnikowia izolátumok fonalas gombákkal szembeni antagonista hatásukat az általuk termelt pulcherrimin pigmentnek köszönhetik. Megfigyeltük, hogy az alacsony pH, a magasabb hőmérséklet, valamint a réz-szulfát (Bordói lé összetevője) csökkenti a pigmentált zóna méretét. A tesztelt szénhidrát források közül a szacharózt érdemes kiemelni, mivel e szénforrás jelenlétében széles pigmentált zóna alakult ki a tesztelt törzsek körül. Továbbá megállapítottuk, hogy a M. andauensis pulcherrimin termelését a tenyésztési közeg összetétele erősen befolyásolta. Munkánk során élesztőgomba-élesztőgomba kölcsönhatásokat is vizsgáltunk. A kísérleteink rávilágítottak arra, hogy ezek a kölcsönhatások különböző típusúak lehetnek. A gátlás mellett például stimulációt is megfigyeltünk, és ezek együttes előfordulására is volt példa. Ezen kívül a megállapítottuk, hogy a humánpatogén fajokhoz tartozó törzsek sokkal toleránsabbak voltak a tesztelt élesztőgombákkal szemben, mint a betegséget nem okozó élesztőgombák. E vizsgálatok során kapott eredmények arra is rávilágítottak, hogy a Pichia kudriavzevii nehezen gátolható fajok közé tartozik. Az opportunista humánpatogén fajok közül a Kodamaea ohmeri és a Candida tropicalis szaporodását a Metschnikowia andauensis, míg a Naganishia albida szaporodását a Pichia anomala vagy a Candida tropicalis gátolta. Továbbá kimutattuk, hogy a M. andauensis képes több olyan gombafaj szaporodását gátolni, amelyek izolátumai humán ferőzésekkel is kapcsolatba hozhatók. Emellett megfigyeltük, hogy a kísérleti körülmények komoly hatással lehetnek az élesztőgombák gátló képességére. A gátlás megjelenése erősen függött a táptalaj összetételétől, a pH-tól és a hőmérséklettől. Összességében az eredményeink felhívják a figyelmet a tenyésztési körülmények antagonizmusban betöltött fontos szerepére és hozzájárulhatnak a jövőbeni vizsgálatok kísérleti körülményeinek pontos kialakításához. Az élesztőgombák ígéretes eszközei lehetnek a humánpatogén gombák elleni küzdelemnek, befolyásolhatják az antimikrobiális kezelés jövőbeli trendjeit, és új gombaellenes szerek forrásai lehetnek.
One of our goals during our work was to search for and identify yeasts with antagonistic against the postharvest pathogen Botrytis cinerea effects. The most effective yeasts were the pigment-producing Metschnikowia isolates with a wide clear inhibitory zone around them. The DNA-based identification of the three pigment-producing Metschnikowia isolates revealed the problem that the 26S ribosomal RNA coding DNA D1/D2 region, which was directly sequenced from the genome, contained ambiguous nucleotides in all three strains. After multiple sequence alignments, it was found that the ambiguous nucleotides can be found in the same positions as in the type strains of the species group. The phenomenon was already described within the group for Metschnikowia fructicola and Metschnikowia andauensis species. We have shown that this also occurs in other members of the group. We found that, like the D1/D2 domain, the ITS region of both species contained ambiguous nucleotides when the region was sequenced directly from the genomes. To resolve this problem, we randomly cloned sequences from the amplified DNA preparation. All M. andauensis and most M. fructicola clones had unique sequences. The revealed polymorphism cannot be attributed to a sequencing error because the variable sites are not randomly distributed in the cloned regions.Taking together the intragenomic D1/D2 diversity and the ITS diversity revealed in this study, it can be concluded that rDNA-based sequencing cannot be used for the taxonomic separation of M. andauensis and M. fructicola, neither from each other nor from other related species. In view of the detected high intragenomic diversity, all strains which were identified with one of these species, should be taxonomically re-examined. In terms of application of yeast in the fields, it is important what are the factors that influence the expression of their antagonist mechanism. Therefore, another goal of our research was to expand our knowledge on how culture conditions affect the antagonistic effect of yeasts. The antagonistic effect of the Metschnikowia isolates against filamentous fungi can be attributed to the pulcherrimin pigment. We observed that low pH, higher temperature, and copper sulfate (a component of the fungicide Bordeaux mixture) reduce the size of the pigmented zone. Among the tested carbohydrate sources, sucrose is worth highlighing, as a wide pigmented zone was formed around the tested strains in the presence of this carbon source. It was found that the production and extent of the pulcherrimin diffusion zone was strongly influenced by the composition of the medium. We also examined the effect of yeasts isolated from nature on each other. Our data also shed some light on the complexity and diversity of the interactions between yeasts. Growth stimulation or co-appearance of inhibitory- and stimulation zones were also noticed aside from inhibition. Our screening revealed that the strains belonging to human pathogenic species were much more tolerant to the yeast-produced bioactive agents than the non-disease-associated yeasts. The results of these studies also revealed that Pichia kudriavzevii is a species that is difficult to inhibit. Among the opportunistic human pathogenic species, the growth of Kodamaea ohmeri and Candida tropicalis was inhibited by Metschnikowia andauensis, while the growth of Naganishia albida was inhibited by Pichia anomala or C. tropicalis. Furthermore, we have shown that M. andauensis is able to inhibit the growth of several fungal species whose isolates can also be associated with human infections. In addition, our results proved that the experimental circumstances can have a serious/ substantial impact on the inhibitory capacity of the yeasts. The appearance of inhibition strongly depended on the media, pH and temperature. Our data revealed an important role of the culturing factors on inhibition and they can contribute to the precise development of experimental conditions of future studies. Yeasts can be promising means of the fight against pathogenic fungi, can influence future trends of the antimicrobial treatment and they can be the new sources of antifungal agents.
Leírás
Kulcsszavak
antagonista élesztők, antagonistic yeast, Metschnikowia, postharvest, biokontroll, biocontrol
Forrás