A 10 napjainkban legnagyobb piaci aránnyal rendelkező gyógyszeripari termék közül nyolc valamilyen bioterápiás fehérjekészítmény. Az optimalizált kezelés érdekében a hagyományos kis molekulatömegű gyógyszeres terápiák kiegészíthetők vagy helyettesíthetők terápiás fehérjékkel, mint például monoklonális antitestek és fúziós fehérjék, a hematológiai és szolidtumorok, valamint autoimmun és gyulladásos betegségek kezelése esetében. Ezen gyógyszerként alkalmazott fehérjéknek a jellemzése rendkívüli kihívások elé állítja a gyógyszeripart, a terápiás fehérjék tisztaságának ellenőrzése, illetve az esetleges szerkezeti eltérések felderítése fontos a minőségellenőrzés szempontjából. A biológiai eredetű gyógyszerkészítmények karakterizálása során a kapilláris elektroforézis (CE) különféle elválasztási módjait rutinszerűen alkalmazzák a minőségellenőrzés során és a fehérje méret és töltés heterogenitásának felmérésére a gyógyszeriparban.
A kapilláris gélelektroforézis (CGE) lehetővé teszi a poliionos makromolekulák hidrodinamikai térfogatuk szerinti elválasztását. Kezdetben térhálósított poliakrilamid géleket alkalmaztak a fehérjék méret szerinti elválasztására, melyeket később felváltottak a hidrofil lineáris polimer mátrixok. Manapság a gyógyszeriparban többnyire borát ionnal reverzibilisen térhálósított dextrán gélt alkalmaznak fehérjék nagy felbontású, méret szerinti elválasztására, mely szabvány módszernek is tekinthető.
A bioterápiás fehérjék növekvő száma miatt, egyre nagyobb szükség van a jobb elválasztási technikákra, melyek például alkalmasak a nagymértékben glikozilált fehérjék jellemzésére is. A nátrium-dodecil-szulfát kapilláris gélelektroforézis (SDS-CGE), mely napjainkban tetrahidroxyborát ionnal reverzibilisen térhálósított dextrán mátrixot alkalmaz elválasztó közegként, egy nagy hatékonyságú bioanalitikai módszer, gyors elemzési idővel és kis mennyiségű mintaigénnyel, így kiválóan alkalmazható terápiás fehérjék hatékony jellemzésére. Célom a módszer optimalizálása a hatékonyabb elválasztás érdekében, többek között annak vizsgálatára, hogy a mérési paraméterek (pl. hőmérséklet) és az elválasztó közeg összetétele (pl. bórsav, dextrán koncentráció), hogyan hat a terápiás fehérjék kvalitatív analízisére. Munkám során a dextrán-borát keresztkötés mechanizmusának vizsgálata különös hangsúlyt kapott. A monomer (dextrán) és a térhálósító (borát) koncentráció változás hatását tanulmányoztam fehérje standardok és antitest minták SDS-CGE elválasztása esetén. A háttér elektrolitok esetében meghatároztam az elválasztás szempontjából fontos fizikai és elektrokinetikus paramétereket, mint például a viszkozitást és az elektroozmotikus áramlást.
A migrációs tulajdonságok behatóbb tanulmányozásához a Ferguson módszert alkalmaztam, mely segíthet a megfelelő összetételű gélt kiválasztani egy adott fehérjekeverék minta esetében. A kapott elektroferogramokat úgy értékeltem ki, hogy részletes információt nyerjek az elválasztások teljesítményét illetően, mint például elméleti tányérszám, felbontás és szelektivitási tényező meghatározása. Vizsgáltam a fehérjék hőmérsékletfüggő migrációját az elválasztások aktiválási energia igényének meghatározása, illetve a felbontás optimalizálása érdekében. Az adott gélrendszerben feltárásra került az aktiválási energia és a molekulatömeg közötti összefüggés, illetve az SDS-fehérje komplex mobilitása és a molekulatömeg közötti összefüggés.
Dolgozatom célja bemutatni 1) a terápiás fehérjék kapilláris gélelektroforézissel történő
analízise során a mérési paraméterek optimalizálása hatékonyabb elválasztást eredményezhet, és számos új típusú glikoprotein esetében nélkülözhetetlen, valamint, hogy 2) a dextrán-borát gél-puffer rendszer tulajdonságainak feltárása, az összetétel változtatásának tanulmányozásával lehetővé teszi az elválasztás mechanizmusának mélyebb megismerését, így segítve a glikoproteinek elválasztása során felmerülő kihívások kezelését.

Of the 10 pharmaceutical products with the largest market share today, eight are biotherapeutic protein products. Therapeutic proteins, such as monoclonal antibodies and fusion proteins, can be added to or substituted for traditional small molecule drug therapies for the treatment of hematological and solid tumors, autoimmune and inflammatory diseases, for optimized treatment. The characterization of these therapeutic proteins is a major challenge for the pharmaceutical industry, and monitoring of the purity of therapeutic proteins and detection of possible structural variations is important for quality control. In the characterization of biologic pharmaceuticals, various separation methods of capillary electrophoresis (CE) are routinely used for quality control and to assess protein size and charge heterogeneity in the pharmaceutical industry.
Capillary gel electrophoresis (CGE) allows the separation of polyionic macromolecules by their hydrodynamic volume. Initially, cross-linked polyacrylamide gels were used to separate proteins by size, which were later replaced by hydrophilic linear polymer matrices. Nowadays, the pharmaceutical industry mostly uses dextran gels reversibly cross-linked with borate ions for high-resolution size separation of proteins, which is also considered a standard method.
Due to the increasing number of proteins in biotherapeutics, there is a growing need for improved separation techniques, which are also suitable, for example, for the characterization of highly glycosylated proteins. Sodium dodecyl sulfate capillary gel electrophoresis (SDS CGE), which nowadays uses a dextran matrix reversibly cross-linked with tetrahydroxyborate ion as separation medium, is a highly efficient bioanalytical method with fast analysis time and low sample requirements, making it an excellent tool for the efficient characterization of therapeutic proteins. My aim was to optimize the method for more efficient separation, including the investigation of how the measurement parameters (e.g. temperature) and the composition of the separation medium (e.g. boric acid, dextran concentration) affected the qualitative analysis of therapeutic proteins. In my work, particular emphasis has been placed on the study of the mechanism of dextran-borate cross-linking. I studied the effect of monomer (dextran) and cross-linker (borate) concentration variation on SDS-CGE separation of protein standards and monoclonal antibody samples. For the background electrolytes, I determined physical and electrokinetic parameters important for the separation, such as viscosity and electroosmotic flow. For a more detailed study of migration properties, I applied the Ferguson method, which can help to select the right gel composition for a given protein mixture sample. The obtained electropherograms were evaluated to achieve detailed information on the performance of the separations, such as theoretical plate number, resolution and selectivity factor determination. I investigated the temperature-dependent migration of proteins to determine the activation energy requirements of the separations and to optimize resolution. The correlation between the activation energy and the molecular weight of the sample molecule was explored in the gel system of interest, as well as the correlation between SDS protein complex mobility and molecular weight.
The aim of my thesis is to demonstrate 1) that optimization of the measurement parameters in the analysis of therapeutic proteins by capillary gel electrophoresis can lead to more efficient separation and is essential for many new types of glycoproteins, and 2) that exploring the properties of the dextran-borate gel-buffer system by studying the variation in composition allows a deeper understanding of the mechanism of separation, thus helping to address the challenges encountered in the separation of glycoproteins.