Cultivation and characterization of adult stem cells from the human eye –relevance to physiology and disease

Albert, Réka

Cultivation and characterization of adult stem cells from the human eye –relevance to physiology and disease

dc.contributor.advisor	Petrovski, Goran
dc.contributor.author	Albert, Réka
dc.contributor.authorvariant	Albert, Réka
dc.contributor.department	Klinikai orvostudományok doktori iskola	hu
dc.contributor.submitterdep	DE--Általános Orvostudományi Kar -- Szemklinika/Biokémiai és Molekulàris Biologiai Intézet
dc.date.accessioned	2014-08-19T09:06:08Z
dc.date.available	2014-08-19T09:06:08Z
dc.date.created	2014	hu_HU
dc.date.defended	2014-09-05
dc.description.abstract	Stem cell therapy holds great promise for treating diseases arising from sight-threatening injuries and disorders such as chemical and thermal burns, AMD or retinitis pigmentosa. Due to ethical issues or the fear of cancer development the use of adult stem cells seems more plausible compared to ESCs or iPSCs. We isolated, cultured and characterized successfully LESCs which are responsible for corneal epithelial regeneration, and confirmed the plausibility of using thin, transparent LCs as biological carriers for future LESC-transplantation. The main benefit of our work is the exclusion of animal materials during cultivation, the use of human serum as the only growth supplement and the extension of the characteristic marker pattern of LESCs with previously not identified markers: CAMs (CD44/HCAM, CD146/MCAM, CD166/ALCAM) and surface glycoproteins. Limbal grafts showed viable cell outgrowth which formed stratified epithelium on LCs within two weeks. The outgrowing cells showed stem cell characteristics (ABCG2, CK19, TP63/p63, VIM/Vim), high proliferation capacity (MKI67/Ki67) and positivity for markers related to the corneal epithelial commitment (CK8/CK18, low CK3/CK12), giving the benefit of having a mixed population of stem cells and TACs. CBE is thought to contain NPCs which can identify retinal injuries like those in RD and consequent PVR, and respond by targeted migration and functional differentiation. In our experiments, no NPC markers in human eyes could be detected, except within peripheral cysts of the proximal Pla and RP; furthermore, GFAP+ cells could only be detected at the RP. Our findings confirm proliferation of GFAP- CBE cells in response to PVR formation, but show no evidence for stemness or photoreceptor differentiation. Only some clusters of Rhodopsin+ cells in the NLR could be found peripheral to the large areas of photoreceptor loss after PVR. In contrast to that, CBE of mice showed hyperplasia and increased Nestin positivity in PVR. Surgeons can often visualize sphere-like structures at the far periphery of the vitreous during vitrectomy for RD with PVR. To identify the origin and characteristics of these spheres, direct isolation from the vitreous and staining before and after cultivation were performed. Immunostaining and TEM of the spheres revealed presence of pigmented and non-pigmented cells, Nestin and GFAP positivity at the central part, β-III tubulin positivity at the periphery and RPE65 negativity excluding contamination with RPE cells. The non-glial and glial response to PVR formation could be confirmed, yet, no evidence for targeted migration of glial cells into the vitreous could be confirmed. Az őssejt-therápia ígéretesnek mutatkozik az olyan súlyos látásromlást okozó károsodások ill. betegségek kezelésében, mint a vegyi sérülések, égések, időskori macula degeneráció vagy retinitis pigmentosa. Az embrionális őssejtek kapcsán felmerülő etikai kérdések és az indukált pluripotens sejtek esetleges tumor-képző tulajdonságától való félelem miatt a felnőtt szöveti őssejtek használhatósága sokkal valószerűbb. Munkánk során sikeresen izoláltunk, tenyészettünk és karakterizáltunk a szaruhártya epithel regenerációjáért felelős limbális epitheliális őssejteket (LESC), valamint a vékony és áttetsző tulajdonsággal bíró lencsetokról (LC) bizonyítottuk, hogy az LESC-transzplantáció számára alkalmas biológiai hordozó. Legfőbb eredményeinknek tartjuk az állati eredetű anyagok teljes kivonását az LESC-tenyésztési procedúrából. A tenyésztés során a humán szérum, mint egyetlen tápanyag-kiegészítőforrást használtuk. Emellett az LESC jellemzésére szolgáló panelt korábban nem vizsgált sejt adhéziós molekulákkal (CD44/HCAM, CD146/MCAM, CD166/ALCAM) és sejtfelszíni glikoproteinekkel bővítettük ki. A limbális graftokból kiinduló sejtek a LC felszínén 2 hét alatt többrétegű hámot hoztak létre. A kinövő sejtek felszínükön őssejt (ABCG2, CK19, TP63/p63, VIM/Vim), a cornea epitheliális irányba való elköteleződés (CK8/CK18, alacsony CK3/CK12) valamint a nagy proliferációs kapacitásra (MKI67/Ki67) utaló markereket expresszálják, így létrehozva egy őssejtekből és tranziensen amplifikálódó sejtek keverékéből álló populációt, annak minden előnyével. Irodalmi adatok alapján feltételezzük, hogy a sugártest epithelsejt rétege (CBE) olyan neuronális pluripotens sejteket (NPC) tartalmaz, amelyek érzékelve a retina károsodását, pl. retina leválásnál és következményesen kialakuló proliferatív vitreoretinopáthia (PVR) esete, célzott migrációval és funkcionális differenciációval reagálnak. Kísérleteink során azonban nem sikerült NPC-t detektálnunk az emberi szemben, a pars plana ill. retina periférián található ún. perifériás cystákon kívül. Mi több, GFAP+ sejteket is csak a retina perifériás részén detektáltunk. Eredményeink alátámasztják a humán GFAP- sejtek proliferációját PVR-ben, de azok őssejt mivoltára vagy fotoreceptorrá való differenciálódásának képességére nem találtunk bizonyítékot. Csupán néhány Rhodopsin+ sejt csoportosulást figyeltünk meg a PVR okozta jelentős fotoreceptor károsodástól perifériásabban. Szemben a humán eredményekkel, egerekben PVR indukálást követően a CB kifejezett hyperplasiáját és emelkedett Nestin pozitivitást tapasztaltunk. PVR-es retina leválás miatti vitrectomia során az operatőrök gyakran észlelnek, a retina perifériához közeli vitreusban gömbszerű struktúrákat. Azért, hogy kiderítsük, ezeknek a szféráknak az eredetét és jellemzőit, a vitreusból nyert mintákat tenyésztés előtt és után is megfestettük. Az immunfluoreszcens festés és transzmissziós elektron mikroszkópia alapján a szférák pigmentált és nem pigmentált sejtekből, valamint Nestin és GFAP pozitív centrális és β-III tubulin+ külső részből állnak, továbbá retina pigmentepithel-sejtes kontamináció-mentesek. Munkánk során a PVR-re adott gliális és nem-gliális válasz megerősítést kapott, de a gliális sejtek vitreusba való migrációja továbbra sem bizonyított.	hu_HU
dc.description.corrector	NE
dc.format.extent	113 (88+25)	hu_HU
dc.identifier.uri	http://hdl.handle.net/2437/195707
dc.language.iso	hu	hu_HU
dc.language.iso	en	hu_HU
dc.subject	Stem Cells	hu_HU
dc.subject	Limbal Epithelial Stem Cells
dc.subject	Retinal Stem Cells
dc.subject	Proliferative Vitreoretinopathy
dc.subject	Őssejtek
dc.subject	Limbális Epitheliális Őssejtek
dc.subject	Retinális Őssejtek
dc.subject	Proloferatív Vitreoretinopathia
dc.subject.discipline	Klinikai orvostudományok	hu
dc.subject.sciencefield	Orvostudományok	hu
dc.title	Cultivation and characterization of adult stem cells from the human eye –relevance to physiology and disease	hu_HU
dc.title.translated	Humán szem eredetű szöveti őssejtek tenyésztése és karakterizálása –szerepük az egészség és betegség közötti egyensúly fenntartásában	hu_HU