A humán immundeficiencia vírus és egér leukémia vírus proteináz működési sajátságainak in vitro tanulmányozása

A tétel rövid nézete
dc.contributor.advisorTőzsér, József
dc.contributor.authorFehér, Anita
dc.contributor.departmentDE -- Orvos- és Egészségtudományi Centrum -- Általános Orvostudományi Kar -- Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézeten
dc.contributor.departmentElméleti orvostudományok doktori iskolahu
dc.date.accessioned2007-05-04T15:37:32Z
dc.date.available2007-05-04T15:37:32Z
dc.date.created2004
dc.date.defended2004-04-27
dc.description.abstractDoktori munkám során lehetőségem nyílt két komoly gyakorlati jelentőséggel bíró retrovírus, a HIV-1 illetve az MuLV proteolitikus enzimének tanulmányozására. A HIV-1 proteinázzal történő vizsgálataimban az AIDS terápiában alkalmazott proteináz gátlószerekkel szemben kifejlődő rezisztencia jelenségét helyeztük a középpontba, és ezt tanulmányoztuk a különböző HIV-1 proteináz illetve Gag hasítási hely mutációk szempontjából. Az általánosan elfogadott elképzelés szerint az aktív centrumot érintő mutációk lerontják, az enzim egyéb régióiban lokalizálódó másodlagos mutációk viszont javítják a proteináz katalitikus hatékonyságát. Eredményeink ezzel részben egybehangzónak (V82S, V82A és L90M), de több esetben ellentmondónak mutatkoztak (I84V és M46L). Elvégeztük a két legnagyobb szekvencia-variabilitással jellemezhető és egyben legkisebb hatékonysággal processzálódó Gag hasítási hely (NC/p1 és p1/p6) eredeti illetve mutáns változatainak a vad típusú és mutáns enzimekkel történő átfogó vizsgálatát. Eredményeinkkel alátámasztottuk, hogy e két Gag hasítási szekvenciában a proteináz inhibitor kezelés hatására megjelenő változások kompenzációs mutációk, melyek ellensúlyozva az enzimaktivitás csökkenésével járó proteináz mutációkat hozzájárulhatnak a gyógyszerrezisztencia kialakulásához. Ugyanakkor kimutattuk, hogy a természetes szekvencia-polimorfizmus nem befolyásolja számottevő mértékben a két hasítási hely processzálhatóságát. A különböző szubsztrátok hasíthatósága kapcsán tapasztalt változások alapján az enzim és szubsztrát között kialakított van der Waals kölcsönhatások maximalizálása tekinthető a specificitás fő meghatározójának, a hasonló hatás kulcsfontosságú lehet az inhibitor-hatékonyságban is. A gyakorlati jelentősége ellenére (génterápiás felhasználás, HIV-1 proteináz elleni gyógyszerfejlesztés) is csak kevéssé ismert MuLV proteinázzal kapcsolatos vizsgálatainkhoz sikerült pMalc2 rendszerben klónoznunk és expresszáltatnunk a fehérjét. Kidolgoztunk egy három lépésből álló eljárást az enzim tisztítására, melynek alacsony hatékonyságán az eredeti konstrukció módosításával és egy újabb tisztítási stratégia kifejlesztésével tudtunk javítani. Az ennek kapcsán végzett kísérleteink által lehetőségünk nyílt a baktériumsejtben történő expresszió során bekövetkező fehérjedegradációs jelenség tanulmányozására is. A tisztított rekombináns enzimet a vírusból izolált formával öszehasonlítva a két enzim viselkedése hasonlónak bizonyult. A rekombináns MuLV-PR működésének a HIV-1 proteinázzal történő részletes összehasonlító vizsgálata során több szinten is rámutattunk azok eltérő sajátságaira. Spektroszkópiás mérés alkalmazásával a két enzim eltérő pH függését tapasztaltuk. A specificitásbeli különbségeket a megfelelő virális hasítási helyeket reprezentáló oligopeptid szubsztrátok mellett különböző hosszúságú MuLV Gag fehérjék szubsztrátként történő alkalmazása során is megfigyeltük. Ezek alapján az MuLV proteináz szélesebb szubsztrátspecificitású viszont szűkebb katalitikus tartománnyal jellemezhető enzimnek bizonyult a HIV-1 proteinázhoz képest. Eredményeink értékelése kapcsán rámutattunk az oligopeptid, fehérje és sejtszintű kísérletekben tapasztalható különbségekre is. Végezetül egy gátlási profilozásra kifejlesztett fluoreszcens módszer segítségével összehasonlítottuk a két enzim klinikai használatba került és más PR inhibitorokkal való gátolhatóságát is, melynek kapcsán az MuLV proteináz HIV-1 PR-hoz képest alacsonyabb érzékenységét figyelhettük meg az AIDS terápiában alkalmzott inhibitorokkal szemben.en
dc.description.degreePhDen
dc.format.extent47 pen
dc.format.extent395517 bytes
dc.format.extent258325 bytes
dc.format.extent1662164 bytes
dc.format.mimetypeapplication/pdf
dc.format.mimetypeapplication/pdf
dc.format.mimetypeapplication/pdf
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/2437/2151
dc.languagehunhu
dc.language.isohuen
dc.language.isoenen
dc.rightsA kéziratos PhD munkák csak a szerzői jogok maradéktalan tiszteletben tartásával használhatókhu
dc.rights.accessno_restrictionen
dc.subject.disciplineElméleti orvostudományokhu
dc.subject.sciencefieldOrvostudományokhu
dc.titleA humán immundeficiencia vírus és egér leukémia vírus proteináz működési sajátságainak in vitro tanulmányozásaen
dc.title.subtitleegyetemi doktori (Ph.D) értekezésen
dc.title.translatedIn Vitro Studies on the Functional Charachteristics of Human Immundeficiency Virus Type-1 Proteinase and Murine Leukemia Virus Proteinaseen
Fájlok
Eredeti köteg (ORIGINAL bundle)
Megjelenítve 1 - 3 (Összesen 3)
Nincs kép
Név:
Feher_Anita_ertekezes.pdf
Méret:
1.59 MB
Formátum:
Adobe Portable Document Format
Letöltés
Nincs kép
Név:
Feher_Anita_tezis_angol.pdf
Méret:
252.27 KB
Formátum:
Adobe Portable Document Format
Letöltés
Nincs kép
Név:
Feher_Anita_tezis_magyar.pdf
Méret:
386.25 KB
Formátum:
Adobe Portable Document Format
Letöltés
Gyűjtemények
Molekuláris Orvostudomány Doktori Iskola