A P-glikoprotein szerkezetének és fehérje interakcióinak vizsgálata keresztkötéses tömegspektrometriával

A tétel rövid nézete
dc.contributor.advisorBacsó, Zsolt
dc.contributor.authorGellén, Gabriella
dc.contributor.authorvariantGellén, Gabriella
dc.contributor.departmentMolekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskolahu
dc.contributor.submitterdepDebreceni Egyetem::Általános Orvostudományi Kar
dc.date.accessioned2024-01-11T13:06:41Z
dc.date.available2024-01-11T13:06:41Z
dc.date.created2023
dc.date.defended2024-01-26
dc.description.abstractAz ABC transzporterek családjába tartozó P-glikoproteinről (Pgp) ismert, hogy részt vesz a tumorsejtek multidrog-rezisztenciájában. A koleszterin és egyéb lipidek kulcsfontosságú szerepet játszanak a Pgp konformációinak kialakításában, ennek azonban a hagyományos szerkezetbiológiai technikákkal történő tanulmányozása igen körülményes. Kísérleteink során újszerű, robusztus mintaelőkészítési módszereket alkalmaztunk keresztkötéses tömegspektrometriás (XL-MS) analízishez, lehetővé téve a Pgp szerkezetének vizsgálatát, annak természetes lipidkörnyezete megtartása mellett. Két kísérleti megközelítést alkalmaztunk: (i) az élő sejteket kezeltük keresztkötőkkel, majd membránpreparálást követően dúsítottuk a keresztkötött Pgp komplexeket; (ii) a keresztkötést az immunprecipitációs gyöngyökön végeztük a membránpreparálást és dúsítást követően. A keresztkötött komplexeket extracellulárisan kötődő monoklonális Pgp-ellenes antitestekkel dúsítottuk mágneses gyöngyökön, majd a gyöngyök felszínén történt az enzimatikus emésztés. Az LC-MS/MS eredmények alapján azonosított mono-linkek a Pgp oldószer számára hozzáférhető aminosav-oldalláncait segítettek feltérképezni. A Pgp-n belüli keresztkötések megerősítették a fehérje extracelluláris, transzmembrán és intracelluláris szegmensei közötti kölcsönhatásokat, melyekről ismert, hogy koleszterinérzékenyek. Tömegspektrometriás eredményeinket irodalmi adatokkal és molekuladokkolással kiegészítve meghatároztuk a 15D3 koleszterinfüggő monoklonális antitest epitópját. Emellett az azonosított Pgp fehérjepartnerek bizonyítják a Pgp szoros kapcsolatát a citoszkeletonnal és egyéb koleszterin által szabályozott fehérjékkel. Eredményeink azt sugallják, hogy az XL-MS felhasználható fehérjeszerkezet- és hálózatelemzésekre olyan összetett rendszerekben is, mint a membránfehérjék.
dc.description.abstractThe ABC transporter P-glycoprotein (Pgp) has been found to be involved in multidrug resistance in tumor cells. Lipids and cholesterol have a pivotal role in Pgp’s conformations; however, it is often difficult to investigate it with conventional structural biology techniques. Here, we applied robust approaches coupled with cross-linking mass spectrometry (XL-MS), where the natural lipid environment remains quasi-intact. Two experimental approaches were carried out using different cross-linkers (i) on living cells, followed by membrane preparation and immunoprecipitation enrichment of Pgp, and (ii) on-bead, subsequent to membrane preparation and immunoprecipitation. Pgp-containing complexes were enriched employing extracellular monoclonal anti-Pgp antibodies on magnetic beads, followed by on-bead enzymatic digestion. The LC-MS/MS results revealed mono-links on Pgp’s solvent-accessible residues, while intraprotein cross-links confirmed a complex interplay between extracellular, transmembrane, and intracellular segments of the protein, of which several have been reported to be connected to cholesterol. Harnessing the MS results and those of molecular docking, we suggest an epitope for the 15D3 cholesterol-dependent mouse monoclonal antibody. Additionally, enriched neighbors of Pgp prove the strong connection of Pgp to the cytoskeleton and other cholesterol-regulated proteins. These findings suggest that XL-MS may be utilized for protein structure and network analyses in such convoluted systems as membrane proteins.
dc.format.extent89
dc.identifier.urihttps://hdl.handle.net/2437/364952
dc.language.isohu
dc.language.isoen
dc.subjectmultidrog rezisztencia
dc.subjectkeresztkötéses tömegspektrometria
dc.subjectP-glikoprotein
dc.subjectkoleszterin
dc.subjectmultidrug resistance
dc.subjectcross-linking mass spectrometry
dc.subjectP-glycoprotein
dc.subjectcholesterol
dc.subject.disciplineElméleti orvostudományokhu
dc.subject.sciencefieldOrvostudományokhu
dc.titleA P-glikoprotein szerkezetének és fehérje interakcióinak vizsgálata keresztkötéses tömegspektrometriával
dc.title.translatedCross-linking mass spectrometry on P-glycoprotein
Fájlok
Eredeti köteg (ORIGINAL bundle)
Megjelenítve 1 - 4 (Összesen 4)
Nincs kép
Név:
ertekezes_gg_20230828_fuggelekkel_corrected bzs_gg_final_titkositott.pdf
Méret:
16.93 MB
Formátum:
Adobe Portable Document Format
Letöltés
Nincs kép
Név:
Tézisek_magyar_gg_corr_titkositott.pdf
Méret:
2.41 MB
Formátum:
Adobe Portable Document Format
Letöltés
Nincs kép
Név:
MEGHÍVÓ.pdf
Méret:
86.84 KB
Formátum:
Adobe Portable Document Format
Letöltés
Nincs kép
Név:
thesis_eng_gg_corr2_titkositott.pdf
Méret:
2.42 MB
Formátum:
Adobe Portable Document Format
Letöltés
Engedélyek köteg
Megjelenítve 1 - 1 (Összesen 1)
Nincs kép
Név:
license.txt
Méret:
1.93 KB
Formátum:
Item-specific license agreed upon to submission
Leírás:
Letöltés
Gyűjtemények
Molekuláris Sejt- és Immunbiológia Doktori Iskola