A magreceptorok szupercsaládjába olyan transzkripciós faktorok tartoznak, melyek ligandfüggő módon képesek célgénjeik átírására. Az általunk vizsgált reténsav (RAR) és D-vitamin receptoroknak (VDR) szerepe van olyan folyamatokban, mint a sejtek növekedése, fejlődése és halála. A rexinoid receptornak (RXR) központi szerepe van a magreceptorok működésében, mivel heterodimerizáló partnerként szolgál számos magreceptor, köztük az RAR és VDR számára is. A magreceptorok működését a molekuláris kapcsoló modell írja le. A modell értelmében ezek a magreceptorok agonista ligand hiányában kromatinhoz kötődve gátolják célgénjeik átírását. Agonista ligand hatására konformációváltozás történik, mely során koaktivátorokat kötve a transzkripciós gépezet aktiválását idézik elő. A magreceptorok működését leíró viszonylag statikus molekuláris kapcsoló modellt a területen zajló intenzív kutatások eredményeképpen egyre dinamikusabb kép kezdi felváltani. Fluoreszcencia korrelációs spektroszkópiai (FCS) vizsgálataink arra utalnak, hogy a magreceptoroknak két eltérő mobilitású populációja van jelen a sejtmagban: a gyors populáció rövid ideig kötődik a kromatinhoz, ez felelhet meg a kromatint pásztázó egydimenziós mozgásnak. Ezzel szemben a lassú populációba tartozó magreceptorok hosszabb ideig kötődnek a kromatinhoz, feltehetően specifikus módon a válaszadó elemekhez. Agonista ligandkezelés vagy RXR kotranszfekció hatására RAR esetében a lassú populáció aránya jelentősen növekedett, mely a kromatinhoz történő erősebb kötődés, a kromatinhoz kötött állapot meghosszabbodásának következménye lehet. Ezzel szemben VDR esetében a lassú populáció aránya csak ligand és RXR együttes hozzáadása mellett növekedett, vagyis a VDR kromatinkötése csak ligandkötött állapotban, RXR-rel heterodimert képezve stabil. Három magreceptort (RAR, VDR, RXR) egy sejtben vizsgálva kimutattuk, hogy az RAR és a VDR versengése az RXR kötődéséért a kromatinkötés szintjén is megjelenik, ami felelőssé tehető a magreceptorokon ható humán terápiák mellékhatásaiért. Ligand hiányában az RXR az RAR-t preferálja a VDR-rel szemben, ligand jelenlétében pedig mindig a ligandkötött receptor képezett heterodimert az RXR-rel. Munkám második fázisában továbbfejlesztettünk egy mikroszkópos módszert, mely lehetővé tette, hogy a sejt egy adott síkjában egyidőben vizsgáljuk a molekulák diffúziós tulajdonságait, valamint a közöttük lévő kölcsönhatásokat. A SPIM-FRET-FCCS módszert használva lehetővé vált a magreceptorok dimerizációjának és komobilitásának egyidőben történő mérése, valamint a magreceptor populációk diffúziós paramétereinek meghatározása a sejt egy adott síkjában. A két módszer kombinálásával lehetőség nyílt olyan interakciók megfigyelésére, melyek vizsgálata FRET (Förster rezonancia energia transzfer) vagy FCCS (fluoreszcencia keresztkorrelációs spektroszkópia) külön-külön történő alkalmazásával félrevezető eredményt adott volna. Alternáló gerjesztés (ALEX) bevezetésével tovább finomítottuk módszerünket, ezáltal csökkent a fluoreszcens fehérjék kiégése és jelentősen javult az FCCS dinamikus tartománya és érzékenysége is. A jelen disszertáció eredményei a későbbiek folyamán segíthetnek a magreceptorok működését befolyásoló terápiás célpontokat találni, valamint felhívják a figyelmet a magreceptorokat célzó terápiák esetében a kompetíció fontosságára. Az általunk kifejlesztett új mikroszkópos módszer más fehérjék esetében is segíthet a molekuláris kölcsönhatások és mobilitás feltérképezésében.

The nuclear receptor superfamily includes transcription factors that can influence the transcription of their target genes by a ligand-dependent manner. Retinoic acid receptor (RAR) and Vitamin D receptor (VDR) play a crucial role in various cell functions, including the regulation of cell homeostasis, differentiation, metabolism, and death. The rexinoid receptor (RXR) plays a central role in nuclear receptor action because it acts as a heterodimerizing partner for many other nuclear receptors.

Nuclear receptor function is traditionally described by the molecular switch model. According to this model, in the absence of ligand, receptors bind to chromatin and associate with a corepressor complex, which inhibits the transcription of their target genes through histone deacetylase activity. In the presence of a ligand, a coregulator exchange occurs, allowing the activation of the transcriptional machinery.

Our FCS (fluorescence correlation spectroscopy) studies showed that there are two distinct populations of nuclear receptor with different diffusion properties are present in the nucleus: a fast population, in which nuclear receptors are bound to the chromatin with lower residence times, these receptors are scanning the DNA for specific response elements, but the stability of chromatin binding is low. Contrary, the receptors in the slow population are bound to the DNA (especially to response elements) with much longer residence times. In the case of RAR, agonist treatment or RXR cotransfection increased the amount of the slow population which is due to the increased stability of chromatin-binding or increased residence time. In contrast to RAR, the slow population of the VDR only increased in the presence of both agonist and RXR, so the chromatin binding of the VDR stable only in liganded, RXR-bound form. By triple co-transfection of RAR, VDR and RXR, we showed that the competition between RAR and VDR for the binding of RXR is appeared on the level of chromatin-binding, which is at least partly responsible for the side effects of nuclear receptor targeted therapies. Without ligands, the RXR showed higher preference for RAR than VDR. In the presence of ligands, always the liganded receptor dominated. We also showed that RAR and VDR cannot heterodimerize with each other in living cells. During the second part of my work, we further developed a microscopic method, which is capable of measuring the diffusion properties of molecules and their association at the same time in a plane of the cell. By using SPIM-FRET-FCCS we measured the dimerization a co-mobility of nuclear receptors at the same time. The combination of the two methods, showed interactions between nuclear receptors, that couldn’t be seen by just using FRET (Förster resonance energy transfer) of FCCS (fluorescence cross-correlation spectroscopy) separately. The application of ALEX made our method more precise by decreased photobleaching and increased dynamic range. The results of this dissertation can help in the search for nuclear receptor-based therapies and raise attention to the importance of competition between nuclear receptors. The new microscopic method can be used in the investigation of other molecular systems as well.