C. elegans protein diszulfid izomeráz transzglutamináz aktivitásának vizsgálata

Abstract

1.Sikeresen klónoztuk a C. elegans PDI-3 cDNS-ét egy indukálható, expressziós vektorba, melynek segítségével előállítottuk a rekombináns fehérjét (rPDI-3). 2.A rekombináns fehérje mind in vitro, mind in vivo kísérletekben aktívnak bizonyult. Az rPDI-3 diszulfid izomeráz aktivitását meghatároztuk, és bizonyítottuk, hogy képes komplementálni a dsbA- deficiens E. coli törzset. 3.A rekombináns fehérje transzglutamináz aktivitással rendelkezett, erről két független mérési módszerrel is megbizonyosodtunk. A transzglutamináz aktivitás csak 55 °C-on volt detektálható, 25 °C-on nem. Meggyőződtünk arról, hogy nem artefactumról van szó, a PDI valóban katalizálja az amin- transzfert a kazein és biotinált amin között, ezt dot blot kísérlettel is igazoltuk. A rekombináns PDI specifikus aktivitását is megmértük, azt a tengerimalac szöveti transzglutaminázával nagyságrendben összehasonlítható értéket adott. 4.Deléciós mutánsok segítségével sikerült lokalizálnunk, hogy a detektált transzglutamináz aktivitásért a fehérje tioredoxin doménje a felelős. 5.Hely-specifikus mutagenezissel kimutattuk, hogy a rekombináns PDI-3 TGáz aktivitása független a PDI katalitikus centrumában található cisztein oldalláncoktól. 6.A tioredoxin domén mutagenezise bebizonyította, hogy a transzamidációban a CGHC tioredoxin motívumban található második cisztein játszik kritikus szerepet. 7.A vizsgált E. coli és humán tioredoxin is transzglutamináz aktivitást mutatott. 8.Mivel tioredoxin doménban egyetlen hisztidin található, ezért megvizsgáltuk, hogy vajon szerepet játszik-e a transzamidációs reakcióban. A hisztidin oldallánc kémiai módosítása a TGáz aktivitás szinte teljes elvesztését eredményezte. Szekvencia összehasonlításokkal két konzerválódott Asp régiót találtunk mind a PDI-ben, mind a tioredoxinban. A PDI-ben, és Trx-ben lehetséges katalitikus triádokat azonosítottunk. Homológ modellezés segítségével megszerkesztettük a C. elegans PDI-3 a doménjának a szerkezetét. 9.Cirkuláris dikroizmus spektroszkópia segítségével kimutattuk, hogy mind a PDI, mind a Trx egy hőmérséklet-indukálta szerkezetváltozáson megy keresztül, ami szükséges feltétele a transzglutamináz reakció in vitro lejátszódásához.