Napjaink technológiai fejlődése lehetővé teszi a fehérjék proteoformáinak egyre részletesebb megismerését, amely hozzájárulhat funkcióik mélyebb megértéséhez és a biomarker alkalmazások bővítéséhez. Korábbi kutatásaink során protein epitóp profilírozással megállapítottuk, hogy a fehérjék epitópjai eltérő módon asszociálnak tüdőrákos plazában az antitestekkel. Ezen vizsgálatok folytatásaként a C9 fehérje epitópjait elemeztük. A QuantiPlasma könyvtárából három anti-C9 antitestet választottunk ki (BSI0449, BSI0581, BSI0639), amelyek eltérő asszociációt mutattak tüdőrákos mintákban (semleges, negatív és pozitív). Az antitesteket Western blottal validáltuk, majd az epitópok függetlenségét vizsgáltuk, amelyek nagymértékben függetlenek voltak egymástól. Tömegspektrometriával kimutattuk, hogy a C9 fehérje peptideloszlása hasonló volt a kontroll és tüdőrákos mintákban, így a szerkezeti eltérések valószínűleg nem magyarázzák az asszociációs különbségeket. A C9 koprecipitált fehérjéit elemezve három eltérést mutató fehérjét azonosítottunk: a C4A erősen asszociált a BSI0449 mintákkal, de hiányzott a BSI0639 tüdőrákos mintákban; a HSP90AB1 a BSI0639 mintákhoz kötődött, de nem volt jelen a BSI0449 mintákban; a HSPA8 kizárólag a BSI0639 mintákban volt jelen. Továbbá, a C9 415-ös pozíciójában N-glikozilációs heterogenitást figyeltünk meg, amelynek aránya jelentősen eltért a kontroll és tüdőrákos minták között a pozitív epitópok esetében. Eredményeink megerősítik, hogy a C9 fehérjének több proteoformája létezik, amelyek eltérő epitópokon keresztül vizsgálhatók. Ezek a proteoformák és a velük koprecipitált fehérjék jelentős biomarker értékkel bírhatnak a tüdőrák diagnosztikájában.

Advancements in modern technology enable the increasingly detailed study of protein proteoforms, which can contribute to a deeper understanding of their functions and the expansion of biomarker applications. In our previous research using protein epitope profiling, we determined that protein epitopes exhibit differential associations with antibodies in lung cancer plasma samples. Building on these studies, we analyzed the epitopes of the C9 protein. From the QuantiPlasma library, we selected three anti-C9 antibodies (BSI0449, BSI0581, BSI0639) that showed distinct associations in lung cancer samples (neutral, negative, and positive). The antibodies were validated using Western blot, and the independence of the epitopes was confirmed, with the epitopes being largely independent. Mass spectrometry revealed that the peptide distribution of the C9 protein was similar between control and lung cancer samples, suggesting that structural differences are unlikely to account for the observed association variations. Analyzing the co-precipitated proteins of C9, we identified three proteins showing differential patterns: C4A was strongly associated with BSI0449 samples but absent in BSI0639 lung cancer samples; HSP90AB1 was associated with BSI0639 samples but not present in BSI0449 samples; and HSPA8 was exclusively found in BSI0639 samples. Furthermore, we observed N-glycosylation heterogeneity at position 415 of C9, with its levels significantly differing between control and lung cancer samples for positive epitopes. Our findings confirm the existence of multiple proteoforms of the C9 protein, which can be studied through distinct epitopes. These proteoforms, along with their co-precipitated proteins, hold significant potential as biomarkers in lung cancer diagnostics. This study provides the first biochemical explanation of the biological relevance of the epitope-based approach.