Az intracelluláris kalciumhomeosztázis szabályozása humán immortalizált keratinocytákon

Dátum
2007-07-20T09:33:33Z
Folyóirat címe
Folyóirat ISSN
Kötet címe (évfolyam száma)
Kiadó
Absztrakt

Kísérleteink során HaCaT keratinocyták kalciumhomeosztázisát, transzmembrán áramait, proliferációját, differenciálódását, ezen folyamatok változásait és szabályozási lehetőségeit tanulmányoztuk. Megállapítottuk, hogy a kapacitatív kalciumbeáramlás, mely a belső raktárakból történő kalciumfelszabaduláshoz szorosan kapcsolódó folyamat, HaCaT sejtek esetében is aktiválható a foszfoinozitol-útvonalon keresztül. Keratinocyták hosszú ideig tartó előkezelése PMA-val a klasszikus, kalcium-dependens PKCα szelektív downregulációját okozta proliferáló sejteken. Bár az előkezelés után a PI-útvonalban nem tapasztaltunk változást, a kapacitatív kalciumbeáramlás fokozódott. Ez arra utal, hogy a PKC rendszer közvetlenül a transzmembrán áramot befolyásolja. Megfigyeléseinket megerősítették a ciklopizonsavval végzett kísérletek is, hisz a kalciumbelépés mértéke 47%-al nagyobb volt PMA-val kezelt sejteken, mint kontroll esetben. Konfluens, azaz differenciálódó keratinocytákban módosult a kapacitatív kalciumbeáramlás kinetikája is, ami a csatornák részleges inaktivációjára utal. Konfluens sejtek PMA-val történő előkezelése a PKCβ és PKCε izoenzimek downregulációját okozta, de nem változtatta meg a SOC aktivitását a kontroll állapothoz képest. Ezen megfigyelésekből arra következtettünk, hogy számos PKC izoenzimnek van szabályozó szerepe a kapacitatív kalciumbeáramlás szabályozásában, de ezek a hatások eltérőek, esetenként akár ellentétesek is lehetnek. A keratinocyták proliferációját és differenciálódását jelentősen megváltoztathatják különböző mechanikai hatások. Munkánk során sikerült stretch-aktivált csatornák jelenlétét kimutatni a HaCaT sejtvonalon. Ezen csatornák hipotóniás stresszel történő aktiválása a sejtek membránpotenciáljának hiperpolarizációs irányba történő elmozdulását okozta, amely változás részlegesen reverzibilis volt. A membránpotenciál hasonló módosulását tapasztaltuk a hidrosztatikai nyomás emelésekor is. A mechanoszenzitív csatornák Cl--ra permeábilisak, mivel Cl--mentes mérőoldatban a korábban tapasztalt változások elmaradtak. Hipotóniás oldatok az intracelluláris kalciumkoncentrációban is növekedést okoztak, a válaszok nagysága erőteljesen függött az extracelluláris kalcium mennyiségétől. Ebből arra következtethettünk, hogy a sejtmembrán feszülése kation-szelektív csatornákat is aktivál. A sejtek PMA-val történő előkezelése növelte a hipotóniás stressz által kialakított válaszokat, feltehetően fokozva a stretch-aktivált csatornák megnyílásának valószínűségét. A csökkentett ozmolaritású tenyésztőoldat folyamatos jelenléte megakadályozta a keratinocyták növekedését. Ha azonban az izotóniás tenyésztőoldatban növekvő sejteken az oldatot hipotóniásra cseréltük le, a proliferáció növekedését és a terminális differenciálódási marker involukrin szintjének csökkenését tapasztaltuk. Ezen megfigyeléseink a mechanikai feszülés megváltoztatásának, mint a proliferáció szabályozásában szerepet játszó külső ingernek a fontosságára mutattak rá. A különböző gyulladásos folyamatok során megnövekvő citotoxikus anyagok apoptózist és nekrózist kialakító hatása a sejtek többségénél összefüggésbe hozható a kalciumhomeosztázis befolyásolásával. Ezt tapasztaltuk a HaCaT sejtek esetében is, ahol mind a peroxinitrit, mind ennek prekurzora, a SIN-1 növelte a sejtek intracelluláris kalciumkoncentrációját. A SIN-1 hatásának kialakításában mind a belső raktárakból felszabadult, mind az extracelluláris térből bejutott kalcium részt vett és a kalciumkoncentrációban bekövetkező változások reverzibilisek voltak. Ezzel ellentétben a PN a sejtmembrán integritásának csökkenését, és ezzel egyidőben az intracelluláris tér kalciumkoncentrációjának folyamatos emelkedését idézte elő.

Capacitative calcium flux is associated with the release of calcium from internal stores and participates in intracellular calcium homeostasis. In keratinocytes, its activation is linked to the stimulation of the phospho-inositide (PI) pathway and seems to be altered in psoriasis. An overnight treatment of preconfluent HaCaT keratinocytes with phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) selectively downregulated the classical, calcium dependent protein kinase C (PKC) isoenzyme PKCα. This was paralleled by an increased capacitative calcium influx with no effect on the PI pathway. These observations were strengthened in measurements using cyclopiazonic acid which revealed a 47% increase in PMA pretreated as compared with control cells in the calcium influx rate through store-operated calcium channels (SOC-s) following the emptying of the intracellular calcium stores. In confluent as compared with preconfluent cultures PKCε was markedly increased, while other isoenzymes were not affected. In parallel, the kinetics of capacitative calcium influx were altered, showing clear inactivation. PMA pretreatment in these cells had little effect on PKCα but downregulated both PKCβ and PKCε, and did not increase the influx through SOC-s. These observations support the differential regulation of SOC-s by PKC and suggest the involvement of several PKC isoenzymes in human keratinocytes. Keratinocyte proliferation and differentiation is strongly influenced by mechanical forces. We demonstrate the presence of stretch-activated channels and their role in the development of the human keratinocyte cell line HaCaT in culture. The activation of these channels by hypotonic stress, to 174 mosmol/l, caused a sustained hyperpolarisation of HaCaT cells from a resting value of -29±4 to -56±9 mV. The changes were partially reversible. Similar alterations in membrane potential (from -20±7 to -55±12 mV) were observed when increasing the hydrostatic pressure. The channels were identified as chloride dependent due to the lack of response in the absence of the anion. Cells responded with an elevation of intracellular calcium concentration to hypotonic stress, which critically depended on external calcium. The presence of PMA in the culture medium for 12 hours augmented the subsequent response to hypotonic stress through influencing stretch-activated channels. If continuously cultured in hypotonic solution the proliferation of keratinocytes was completely supressed. In contrast, a sudden switch from iso- to hypotonic solution increased cell proliferation and supressed the production of involucrin, the marker of terminal differentiation. Keratinocytes are regarded as highly resistant toward enviromental noxa including oxidative stress. We investigated the possible role of intracellular calcium mobilisation in the regulation of the oxidative stress sensitivity of HaCaT cells. We have characterized the effect of peroxynitrite on the calcium homeostasis of HaCaT cells and found that both authentic peroxynitrite and the peroxynitrite generating compound SIN-1 triggered an elevation in intracellular calcium level. SIN-1 supressed the ATP-evoked calcium transients in calcium free extracellular solution by releasing calcium from the internal stores.

Leírás
Kulcsszavak
Forrás