Az ABCG2 konformáció változásainak vizsgálata 5D3 antitest segítségével
Absztrakt
A humán ABCG2/BCRP (mellrák-rezisztencia fehérje) az ABC-kazettás transzporterek G alcsaládjának a második tagja, amelyet multidrog rezisztens daganatos sejtvonalakon fedeztek fel. A P-glikoproteinhez (Pgp, ABCB1) és a multidrog rezisztencia fehérjéhez (MRP1, ABCC1) hasonlóan képes a daganat ellenes szereket kipumpálni a sejtekből, ezáltal multidrog rezisztenciát okozni tumorokban.Emellett a transzporter szöveti lokalizációja és szubsztrátjai alapján feltételezhetjük, hogy fontos szerepet tölt be a különböző gyógyszerek és xenobiotikumok abszorpciójában, eliminációjában és szervezeten belüli disztribúciójában. Az ABCG2 a többi ABC transzporterhez hasonlóan szubsztrátjait koncentráció gradienssel szemben pumpálja ATP hidrolízisből származó energiát felhasználva. Az azonban, hogy az ABCG2 ATP kötését és hidrolízisétmilyen konformáció változások kísérik és ezek milyen kapcsolatban vannak a szubsztrátokmegkötésével és transzportjával, még kevéssé ismert. Számos ABC transzporter szerkezete alapján feltételezhetjük, hogy a P-glikoproteinhez hasonlóan az ABCG2 is egy nukleotid mentes, intracelluláris oldalról nyitott és egy nukleotid kötött intracelluláris oldalról zárt konformáció között fluktuál. Komplex epitóppal rendelkező konformáció érzékeny antitest felhasználásával, ezek a konformációk megkülönböztethetők, a konformerek aránya meghatározható. Kísérleteimben a Pgp esetén már beállított konformáció változások detektálására alkalmas vizsgálati rendszerhez hasonló létrehozását terveztem az ABCG2 fehérje esetében. A vizsgálatokhoz MDCK (Madin-Darby Canine Kidney) sejtvonalat, valamint annak humán ABCG2-vel transzfektált változatát használtam, és 5D3 konformáció érzékeny kötődésű antitest segítségével tanulmányoztam, hogy különböző, azABCG2 konformációs állapotát feltételezhetően befolyásoló kezelés (Ko143, Na-ortovanadát, valamint az eltérő ATP koncentrációk) hatására hogyan változik afehérje5D3-által felismerhető konformereinek aránya. Kísérleteim során azt találtam, hogy az ABCG2 fehérjét magas szinten kifejező MDCK sejtvonal és az 5D3 mAt jól használhatóaz ABCG2 fehérje konformáció változásainak tanulmányozására intakt és permeabilizált sejteken egyaránt.