Az AtfA és AtfB bZIP típusú transzkripciós faktorok vizsgálata Aspergillus nidulans fonalas gombában

Kocsis, Beatrix

Az AtfA és AtfB bZIP típusú transzkripciós faktorok vizsgálata Aspergillus nidulans fonalas gombában

dc.contributor.advisor	Leiter, Éva
dc.contributor.author	Kocsis, Beatrix
dc.contributor.department	Gyógyszertudományok doktori iskola	hu
dc.contributor.submitterdep	Természettudományi és Technológiai Kar
dc.contributor.submitterdep	Természettudományi és Technológiai Kar::Biotechnológiai Intézet
dc.contributor.submitterdep	Természettudományi és Technológiai Kar::Biotechnológiai Intézet::Molekuláris Biotechnológiai és Mikrobiológiai Tanszék
dc.date.accessioned	2024-08-27T15:48:32Z
dc.date.available	2024-08-27T15:48:32Z
dc.date.created	2024
dc.date.defended	2024-09-11
dc.description.abstract	A dimer bázikus leucin cipzár (bZIP) fehérjék konzervált transzkripciós enhancerek, amelyek minden eukariótában megtalálhatók. Kritikus, gyakran fajspecifikus szerepet töltenek be a szervezet fejődésének számos vonatkozásában . Az eukariótákban változatos szerepük van az egyes sejttípusok differenciációjában, azok fenntartásában, de részt vesznek emellett különböző stresszválaszokban, a sejtproliferáció szabályozásában, illetve a homeosztázis fenntartásában. Ezen bZIP transzkripciós faktorok fonalas gombákban a különböző fejlődési folyamatok, a stresszválaszok és a szekunder metabolit termelés fontos szabályozóiként szerepelnek. Jelen értekezés célja volt az A. nidulans fonalas gomba bZIP-típusú transzkripciós faktorait kódoló atfA és atfB géneknek a funkcionális analízise, valamint újgenerációs RNS szekvenálással a deléciós mutánsok (ΔatfA, ΔatfB, ΔatfAΔatfB) transzkriptomikai tanulmányozása. Az atfA és atfB gének élettani funkcióinak analíziséhez létrehoztuk a deléciós és a túltermelő mutánsokat az összes kombinációban: ΔatfA, ΔatfB, ΔatfAΔatfB, ΔatfAatfBOE, ΔatfBatfAOE. atfAOE, atfBOE és atfAOEatfBOE. Kísérleteink megerősítették hogy az AtfA az oxidatív stresszel szembeni védekezésben játszik szerepet, valamint igazoltuk, hogy az ivaros szaporodásban is kulcsfontosságú, deléciója esetén (önmagában vagy az atfB deléciójával együtt) a kleisztotéciumok képződése elmaradt. Az ivaros szaporodás és a szekunder anyagcsere között fennálló szoros kapcsolatot bizonyította az a tény, hogy az atfA deletált törzs ivaros szaporodási zavarával egyidőben a sterigmatocisztin mikotoxin szintézis leállása következett be. Az AtfB funkciójával kapcsolatban világossá vált, hogy elsősorban a hő és a nehéz fém stressz elleni védelemben játszik szerepet, valamint a konídiospórák fejlődését is szabályozza, befolyásolva a konídiumok mennyiségét. Eredményeinkből kiderült továbbá az, hogy bizonyos élettani funkciókat mindkét bZIP transzkripciós faktor szabályoz, erre láttunk példát a hőstresszt, az ivaros szaporodást, konidiospóraképzést és a sterigmatocisztin termelést vizsgáló kísérleteinknél. A kontroll és a deléciós törzsek transzkriptomjának összehasonlító analízise rámutatott az A. nidulans stresszválaszaiban elsődleges bZIP TF funkciót betöltő AtfA-val kapcsolatban arra, hogy ezen gén hiányában a micélium és konídium mintáknál egyaránt jóval nagyobb számban találtunk alul-és felülszabályozott géneket illetve, hogy az AtfB-függő gének AtfA-tól való függéssel szintén jellemezhetők voltak. A két fejlődési állapot esetében azt a következtetést tudtuk levonni, hogy a konídium mintáknál az atfA és atfB mRNS szintje jóval magasabb volt, illetve több AtfA és AtfB-függő gént tudtunk azonosítani. Az MSB-vel történő kezelés hatására a csak AtfB-függő gének száma csökkent jelentős mértékben, ami pedig a kontroll törzs MSB-kezelt micélium mintájának és a ΔatfA mutáns konídium mintájának mRNS szintjének csökkenését idézte elő. Megállapítottuk, hogy az MSB kezelt és a kezeletlen minták AtfA-függő génjei közötti átfedés a micélium mintáknál alacsony volt. A génexpressziós vizsgálattal tehát feltártuk, hogy az atfA és atfB gének sejttípus-függést mutató szabályozó szereppel jellemezhetők a vizsgált A. nidulans fonalas gomba esetén, emellett, hogy az AtfA sokkal fontosabb szerepet tölt be a szabályozási hálózat elemeként, mint az AtfB. Összességében elmondható, hogy eredményeink szerint az AtfA és AtfB között valószínűleg egy olyan interakció valósul meg, amely a stressztoleranciában, ivaros és ivartalan szaporodásban, valamint a szekunder metabolit termelésben résztvevő gének expresszióját képes szabályozni. Ezért további kutatási terveink között szerepel ezen feltételezett interakció bizonyítása. Így tervezzük a promótereken lévő AtfA és AtfB kötőhelyek genomszintű meghatározását kromatin-immunprecipitációs szekvenálással (ChIP-Seq), valamint az AtfA-AtfB heterodimer képzés igazolását bimolekuláris fluoreszcencia komplementációs (BiFC) technikával.
dc.description.abstract	The dimeric basic leucine zipper (bZIP) proteins are conserved transcriptional enhancers found in all eukaryotes. They play a critical, often species-specific role in many aspects of the development of an organism. In eukaryotes, they play a diverse role in the differentiation and maintenance of cell types, but are also involved in various stress responses, regulation of cell proliferation and maintenance of homeostasis. These bZIP transcription factors are important regulators of various developmental processes, stress responses and secondary metabolite production in filamentous fungi. The aim of this thesis was the functional analysis of the atfA and atfB genes encoding bZIP-type transcription factors of the filamentous fungus A. nidulans, and the transcriptomic study of the deletion mutants (ΔatfA, ΔatfB, ΔatfAΔatfB) by next-generation RNA sequencing. To analyze the physiological functions of the atfA and atfB genes, we generated the deletion and overexpression mutants in all combinations, namely: ΔatfA, ΔatfB, ΔatfAΔatfB, ΔatfAatfBOE, ΔatfBatfAOE, atfAOE, atfBOE and atfAOEatfBOE. Our experiments confirmed that AtfA is involved in the defense against oxidative stress, and we also proved that it also plays an important role in sexual reproduction, its deletion (alone or together with the deletion of atfB), caused the inhibition of cleistothecia formation. The close link between sexual reproduction and secondary metabolism was demonstrated by the fact that disturbances in the sexual reproduction coincided with the failure of the mycotoxin sterigmatocystin synthesis in ΔatfA. Regarding the function of AtfB, it is elucidated that it mainly plays a role in the protection against heat and heavy metal stress, it also coordinates the development of conidiospores, by influencing the amount of conidia. Our results also shed light on that certain physiological functions are regulated by both bZIP transcription factors, for instance while studying heat stress, sexual reproduction, formation of conidia and sterigmatocystin production. A comparative analysis of the transcriptome of the control and deletion strains showed that by deletion of atfA, encoding the primary bZIP TF in the stress responses of A. nidulans, a much larger number of down- and up-regulated genes were found in both the mycelium and conidium samples, and that AtfB-dependent genes were also characterized by the dependence on AtfA. Examining the two developmental stages we could conclude that the conidial samples had much higher levels of atfA and atfB mRNA and we were also able to identify more AtfA- and AtfB- dependent genes. As a result of the treatment with MSB, the number of only AtfB dependent genes decreased significantly, bringing about a decrease in the mRNA level of the MSB-treated mycelium sample of the control and the ΔatfA mutant conidia. We found that the overlap between AtfA-dependent genes of MSB-treated and untreated samples was low in mycelial samples. Gene expression analysis unfolded that the atfA and atfB genes have cell type-dependent regulatory roles in the studied filamentous fungi A. nidulans, and that AtfA plays a more important role as a component of the regulatory network than AtfB. Summing it up, according to our results there is probably an interaction between AtfA and AtfB that can regulate the expression of genes involved in stress tolerance, sexual and asexual reproduction and secondary metabolite production. Therefore, our further research plan is to demonstrate this putative interaction. We are planning to determine the AtfA and AtfB binding sites on the promoters at the genome level by chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-Seq) and to confirm AtfA-AtfB heterodimer formation by bimolecular fluorescence complementation (BiFC) technique.
dc.format.extent	97
dc.identifier.uri	https://hdl.handle.net/2437/379335
dc.language.iso	hu
dc.subject	Aspergillus nidulans, bZIP típusú transzkripciós faktorok, atfA és atfB, sterigmatocisztin mikotoxin, stresszérzékenységi vizsgálatok, ivaros és ivartalan szaporodás, transzkriptomika
dc.subject.discipline	Gyógyszertudományok	hu
dc.subject.sciencefield	Orvostudományok	hu
dc.title	Az AtfA és AtfB bZIP típusú transzkripciós faktorok vizsgálata Aspergillus nidulans fonalas gombában
dc.title.translated	Study on the AtfA and AtfB bZIP-type transcription factors in the filamentous fungus Aspergillus nidulans