Analysis of antimicrobial proteins of tears and sweat in health and pathological conditions

Dátum
Szerzők
Kalló, Gergő
Folyóirat címe
Folyóirat ISSN
Kötet címe (évfolyam száma)
Kiadó
Absztrakt
A disszertáció a kémiai barrier részét képező antimikrobiális és immunmodulátor fehérjék mennyiségi változásainak vizsgálatára fókuszál epitél sejtkultúrában valamint könny és verejték mintákban célzott proteomikai módszer alkalmazásával. Vizsgálatainkhoz SRM alapú célzott tömegspektrometriás módszert fejlesztettünk β-defenzin 1-4, lipokalin-1, laktotranszferrin, extracelluláris glikoprotein lakritin, lizozim-C, lipofilin A, Ig λ-lánc C régió, prolaktin indukált fehérje, Zn-α-2-glikoprotein, galektin 3 kötő fehérje és dermcidin fehérjék szemi kvantitatív meghatározására komplex biológiai mintákban. Sejtkultúrákon végzett kísérleteink során igazoltuk a β-defenzin 2 és 3 fehérjék expressziójának indukcióját gyulladásos jel hatására, emellett bizonyítottuk, hogy a β-defenzin 1 és 4 nem indukálódik klasszikus gyulladásos stimulusra. A β-defenzinek mennyiségét könnymintákban vizsgálva megállapítottuk, hogy az SRM módszer alkalmas β-defenzinek vizsgálatára kis mennyiségű biológiai mintákból is. Mivel bizonyított, hogy a kémiai barrier patológiás esetekben megváltozik, emellett bizonyították a könnyfehérjék mennyiségi változását neurodegeneratív betegségekben, megvizsgáltuk a β-defenzin 1-4 mennyiségét Alzheimer-kóros betegektől származó könnymintákban. A β-defenzinek mennyisége a kimutatási határ alá esett, így a könnymintákat további vizsgálatoknak vetettük alá. Szignifikáns növekedést tapasztaltunk az Alzheimer-kóros betegek könny szekréciós rátájában és a könny fehérje koncentrációjában, emellett megfigyeltük a fő könnyfehérjék mennyiségének csökkenését a kontroll csoporthoz képest. SRM kísérletekkel igazoltuk a fő könnyfehérjék mennyiségének csökkenését, valamint a dermcidin szint emelkedését. ROC analízisek segítségével kimutattuk, hogy a lipokalin-1, lizozim-C, dermcidin és lakritin fehérjék kombinációja biomarkerként használható lehet az Alzheimer-kór diagnózisában. A könny mellett a verejtékben lévő AMPk is a kémiai barrier részét képezik és mivel a verejték normál fehérjetartalmát részletesen nem tanulmányozták, tömegspektrometriás módszerek segítségével meghatároztuk a normál verejték proteomot. Vizsgálatainkban 95 fehérjét azonosítottunk ezekből 20 fehérjét eddig még nem azonosítottak a verejték alkotójaként. Az azonosított abundáns fehérjék a dermcidin, prolaktin indukált fehérje, kalszterin, apolipoprotein D és a szérum albumin a kémiai barrier fontos alkotórészei. Eredményeink alátámasztják a célzott proteomika módszerek felhasználhatóságát és fontosságát a testfolyadékokból történő biomarker kutatások területén.
The thesis focuses on the examination of quantitative changes of AMPs in colonic epithelial cells, tears and the sweat using targeted proteomics approaches. SRM-based targeted proteomics approach was developed and optimized for the semi-quantitative analysis of β-defensin 1-4, lipocalin-1, lactotransferrin, extracellular glycoprotein lacritin, lysozyme-C, lipophilin A, Ig λ-chain C region, prolactin-inducible protein, Zn-α-2-glycoprotein, galectin 3 binding protein and dermcidin, in complex biological samples. Our studies on cell cultures have proved the inducible feature of β-defensin 2 and 3 during inflammation, and we have demonstrated that β-defensin 1 and 4 cannot be induced by classical proinflammatory cytokines. We have analyzed the levels of β-defensins in tears, and based on the results, the designed SRM assay is suitable for the quantitative analysis of β-defensins in body fluids typically of low sample volume. Given the facts that the composition of the AMP cocktail changes in pathological conditions and alterations in tears of patients with neurodegenerative diseases were demonstrated, we have analyzed the levels of β-defensin 1-4 in tears from patients with Alzheimer’s disease, but their levels were under the detection limit of the mass spectrometer. In order to gain more insight into the eye-related protein changes of AD, a more detailed analysis was performed. Significant increase in the tear flow rate and protein concentration was observed in patients with Alzheimer’s disease, additionally; reduced level of the major tear proteins was also demonstrated. The decreased level of the major tear proteins and the increased level of dermcidin were demonstrated using SRM-based targeted proteomics analysis. In order to test which proteins with a significant difference can be used as potential biomarkers, ROC analysis was performed and the combination of lipocalin-1, dermcidin, lysozyme-C and lacritin was shown to be potential biomarker. Beside tears, sweat is also a part of the chemical barrier, and considering that the protein composition of the normal sweat has not been examined in details, we have analyzed the sweat proteome using mass spectrometry. We have identified 95 proteins, 20 of them were not reported as sweat proteins previously. The highly abundant sweat proteins dermcidin, prolactin-inducible protein, clusterin, apolipoprotein D and serum albumin are essential parts of the chemical barrier. Our results demonstrate the relevance and utility of targeted proteomics approaches in biomarker studies from human body fluids.
Leírás
Kulcsszavak
Testfolyadék, Body fluids, antimikrobiális és immunmodulátor peptidek/fehérjék, biomarker, kvantitatív proteomika, módszerfejlesztés, könny, verejték, Alzheimer-kór, antimicrobial and immunomodulatory peptides/proteins, biomarker, quantitative proteomics, method development, tears, sweat, Alzheimer’s disease
Forrás