A venezuelai ló-láz encephalitis vírus (VEEV) egy emberekben is súlyos, esetenként halálos kimenetelű megbetegedést okozó vírus. A vírus életciklusában kulcsszerepet tölt be a nem-szerkezeti fehérje 2 proteáza (nsP2pro), amely a virális poliprotein funkcionális egységekre hasítását végzi, és a gazdasejt egyes, immunválaszban szerepet játszó fehérjéit is képes elhasítani. Jelenleg sincs engedélyezett vakcina vagy antivirális gyógyszer a VEEV fertőzés megelőzésére vagy kezelésére, ezért az nsP2pro fontos gyógyszercélpont, ami indokolja vizsgálatát. Kutatásaink során célul tűztük ki, hogy a VEEV nsP2pro specificitásának és konformációs állapotainak kísérletes vizsgálatához kapcsolódóan elvégezzük a fehérje szerkezetének molekuladinamikai módszerekkel történő vizsgálatát, az in vitro vizsgálatok eredményének értelmezése, valamint a szerkezet-funkció összefüggések meghatározása érdekében. A VEEV nsP2pro szubsztrát-specificitásának kísérletes vizsgálatához kapcsolódóan modelleztük az enzim és az in vitro hasítási reakciókban is alkalmazott szubsztrát komplexét, majd a molekudinamikai módszerekkel ekvilibrált szerkezet vizsgálatával meghatároztuk az egyes szubsztrátkötő helyeken kialakuló enzim-szubsztrát kölcsönhatásokat. A szerkezet számítógépes vizsgálata segítségével feltérképezhettük az egyes szubsztrátkötő helyek aminosav-preferenciáit meghatározó szerkezeti sajátságokat. A VEEV nsP2pro kísérletes vizsgálatának részeként röntgenkrisztallográfiával meghatároztuk a VEEV nsP2pro szerkezetét. A feloldott szerkezetben az enzim egy öninaktivált konformációs állapotát figyeltük meg, melyben az enzim N-terminális régiója az aktív hely irányába fordulva helyezkedett el, elfoglalva a szubsztrátkötő helyet. Munkánk során elvégeztük az aktív és öninaktivált konformációs állapotokat reprezentáló nsP2pro kristályszerkezetek összehasonlító vizsgálatát, továbbá molekuladinamikai szimulációk segítségével vizsgáltuk a VEEV nsP2pro konformációs állapotait. Munkánk eredményeként feltérképeztük az enzim aktív helyén kialakuló kölcsönhatási hálózatokat, meghatároztuk az aktív és inaktív konformációs állapotok sajátságait, valamint az enzim stabilitásában fontos szerepet játszó szerkezeti tulajdonságokat. Eredményeink hozzájárulhatnak a VEEV nsP2Pro specificitását és stabilitását meghatározó szerkezeti sajátságok jobb megértéséhez, és felhasználhatóak lehetnek az enzim gátlását célzó molekulák fejlesztéséhez.

The Venezuelan equine encephalitis virus (VEEV) can cause severe and occasionally fatal disease in humans. The non-structural protein 2 protease (nsP2pro) plays a crucial role in the life cycle of VEEV via proteolytic processing of the viral polyprotein into functional units, and the cleavage of host cells’ proteins (those being involved in immune responses). Currently, no vaccines or antiviral drugs are available for the prevention or the treatment of VEEV infection, respectively. Therefore, the nsP2pro is considered to be an important drug target and its investigation has a special importance. In the frame of our work we aimed to investigate the protein structure by using molecular dynamics, in order to support the experimental studies on the specificity and conformational states of VEEV nsP2pro, and to interpret the results of the in vitro experiments and determine the structure-function relationships. In connection with the experimental investigation of VEEV nsP2pro’s substrate specificity, we modeled the complex of the enzyme and the substrate that was applied in the in vitro cleavage reactions. The enzyme-substrate interactions were determined for each substrate binding site based on the structure of the enzyme-substrate complex equilibrated with molecular dynamics. Based on the computational structural analysis we were able to map the structural features that determine the amino acid preferences of the studied substrate binding sites. The determination of nsP2pro’s structure with X-ray crystallography was also part of the experimental studies, which revealed a self-inactivated conformation of the enzyme, in which the N-terminus is bound to the active site, occupying the substrate binding site. In this work we performed a comparative analysis of nsP2pro crystal structures representing the active and self-inactivated conformations, and the individual conformational states were further investigated with the application of molecular dynamics simulations. As a result of our work, we mapped the interaction networks of the active site, determined the characteristics of the active and inactive conformational states, as well as the structural properties that contribute to the stability of the enzyme. Our results might aid a deeper understanding of the structural properties that determine the specificity and stability of VEEV nsP2pro, and can be potentially used for the design of inhibitor molecules.