dc.contributor.advisor	Vereb, György
dc.contributor.author	Kakuk, Annamária
dc.contributor.department	Molekuláris orvostudomány doktori iskola	hu
dc.contributor.submitterdep	DE--OEC--Általános Orvostudományi Kar--Orvosi Vegytani Intézet
dc.date.accessioned	2008-11-24T13:11:18Z
dc.date.available	2008-11-24T13:11:18Z
dc.date.defended	2008-10-14
dc.date.issued	2008
dc.description.abstract	A PI4K230 sejtmagi jelenlétét bizonyító, továbbá a magi fehérje kölcsönható partnereit vizsgáló és sejtmagi, illetve magvacskába történő transzportjának megismerését célzó kísérletes munkánk eredményei az alábbiakban foglalhatók össze: A PI4K230 fehérje 4 különböző epitóp-specifikus antitest felhasználásával, indirekt immunfluoreszcenciával kimutatható az etanollal fixált neuronális és nem-neuronális sejtek nukleoluszában, ahol a kolokalizációs vizsgálatok szerint elsősorban a denz fibrilláris komponensben jelenik meg. A PFA kezelés immunoblotton és sejt lizátumban nem befolyásolja a PI4K230 immunreaktivitását, de a magvacskában feltehetően a PI4K230-al szorosan asszociáló makromolekulákkal keresztkötve reverzibilisen maszkírozza annak immunreaktív epitópjait. Az siRNS kezelés következtében tapasztalható endogén PI4K230-szint csökkenés elsősorban a citoplazmatikus és a nukleoláris formát érinti. A megmaradt fehérjék jelentős része a sejtmagban akkumulálódik. A PI4K230 detergens-rezisztens módon, valószínűleg proteo-lipid komplexekben található a sejtmagvacskában és közvetlen vagy közvetett kapcsolatban áll a nukleolusz DNS és / vagy. RNS komponenseivel. Bár a transzfektált COS-7 sejtek rekombináns PI4K230 fehérjéje 2 napos kifejeződést követően sem jelenik meg a sejtmagban, az Sf9 sejtekben expresszált PI4K230 retikulocita lizátumos import rendszerrel transzportálódik a digitoninnal permeabilizált HeLa sejtek magjába. A PI4K230 monopartit NLS-e (NLS1) által közvetített sejtmagi import lektin-érzékeny, energia-függő folyamat, amely az NLS1 szekvenciával közvetlen kölcsönhatásba lépő importin α1/β és importin α3/β dimer transzport faktorok által vezérelt útvonalakon történik. A PI4K230 bipartit NLS-ét magába foglaló expresszált peptid (506 aminosav) lektin és energia-függő módon, importin α1/β és importin α3/β dimer transzport faktorokkal importálódik a sejtmagba, illetve a nukleoluszba. Habár a szintetikus bipartit NLS szekvencia (NLS2) nem képes a BSA sejtmagi transzportját előidézni, azonban a kis molsúlyú tripszin inhibítorhoz kapcsolva, mely akadálytalanul halad át az NPC-n, annak nukleoláris feldúsulását okozza. Ebben a tekintetben a teljes NLS2 hatékonyabb nukleoláris akkumulációt eredményez, mint fragmentjei. ----- We set as an aim to investigate the possible nuclear occurrence of PI4K230, to find its interaction partners, and to uncover molecular mechanisms by which nuclear and nucleolar transport of PI4K230 occurs. Our results are summarized as follows: The presence of PI4K230 in the nucleoli of ethanol fixed neuronal and non-neuronal cells with indirect immunofluorescence using antibodies to four of its distinct epitopes. Based on our colocalisation results, nucleolar PI4K230 exhibits prominent staining in dense fibrillar components. PFA treatment had no effect on immunoreactivity of PI4K230 in cell lysate or immunoblot but masked reversibly the immunoreactive epitopes of PI4IK230 in the nucleolus by crosslinking PI4K230 with tightly associated nucleolar components. In experiments with siRNA interfering with the expression of PI4K230, elimination of PI4K230 immunoreactivity from the cytoplasm and nucleoli was observed, while the remaining PI4K230 accumulated in the nucleus. The PI4K230 exists in detergent-resistant proteolipid complexes of the nucleolus interacting with nucleolar DNA and/or RNA, either directly or through associated nucleic acid-bound constituents. Though recombinant PI4K230 expressed in COS-7 cells does not accumulate in the nucleolus even after 2 days but in transport assays PI4K230 expressed in Sf9 cells enriches in the nucleoplasm of digitonin permeabilized HeLa cells. Nuclear import directed by the monopartite NLS (NLS1) of PI4K230 is a WGA-sensitive and energy-dependent process mediated by importin α1/β and importin α3/β complexes that interact directly with NLS1. An expressed 506 amino aid fragment of PI4K230 containing its bipartite NLS is effectively transported to the nucleolus with importin α1/β and importin α3/β heterodimers in a WGA-sensitive and energy-dependent manner. Although the bipartite NLS sequence (NLS2) itself linked to BSA does not translocate to the nucleus, but when linked to trypsin inhibitor that small enough to pass freely the NPC it directs the cargo to the nucleolus. In this capacity, the complete NLS2 is more potent than either of its two fragments.	en
dc.format.extent	109 p.	en
dc.identifier.uri	http://hdl.handle.net/2437/31362
dc.language.iso	hu	en
dc.language.iso	en	en
dc.subject	foszfatidilinozitol 4-kináz izoformák	en
dc.subject	Phosphatidylinositol 4-kinase isoforms	en
dc.subject	sejtmagvacska	en
dc.subject	nucleous	en
dc.subject	epitóp maszkírozás	en
dc.subject	epitope masking	en
dc.subject	sejtmagi import	en
dc.subject	nuclear import	en
dc.subject	nukleáris lokalizációs szignál	en
dc.subject	nuclear localisation signal	en
dc.subject	sejtmagvacskába irányító szignál	en
dc.subject	nucleolar targeting signal	en
dc.subject	immunfluoreszencia	en
dc.subject	immunofluorescence	en
dc.subject	permeabilizált HeLa sejtek	en
dc.subject	permeabilized HeLa cells	en
dc.subject	PI4K230	en
dc.subject.discipline	Elméleti orvostudományok	hu
dc.subject.sciencefield	Orvostudományok	hu
dc.title	A foszfatidilinozitol 4-kináz PIK230 izoformájának sejtmagi / nukleoláris lokalizációja és transzport mechanizmusa	en
dc.title.translated	Nuclear / Nucleolar Localisation and Transport Mechanism of Phosphatidylinositol 4-kinase Isoform PI4K230	en
dc.type	PhD, doktori értekezés	hu

A foszfatidilinozitol 4-kináz PIK230 izoformájának sejtmagi / nukleoláris lokalizációja és transzport mechanizmusa

Fájlok

Eredeti köteg (ORIGINAL bundle)

Engedélyek köteg

Gyűjtemények