Development and characterization of experimental tools for functional genomics research

A tétel rövid nézete
dc.contributor.advisorBálint, Bálint László
dc.contributor.authorOzgyin, Lilla
dc.contributor.authorvariantOzgyin, Lilla
dc.contributor.departmentMolekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskolahu
dc.contributor.submitterdepDE--Általános Orvostudományi Kar -- Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet
dc.date.accessioned2019-11-26T07:15:18Z
dc.date.available2019-11-26T07:15:18Z
dc.date.created2019hu_HU
dc.date.defended2019-12-09
dc.description.abstractA funkcionális genomikai módszerek, amelyek lehetővé teszik a génszabályozás különböző aspektusainak genomszintű vizsgálatát, az elmúlt évtizedben látványos fejlődésen és érésen mentek keresztül. Emellett a meglévő források hatékonyabb felhasználásának érdekében új tudományos együttműködési platformok jelentek meg. A doktori értekezés három fő témakör keretében tárgyalja a funkcionális genomika tudományterülethez kapcsolódó fejlesztési és vizsgálati eredményeinket. Munkánk során kifejlesztettünk egy új, bakteriofág-alapú spike-in folyamatkontroll rendszert kromatin immunprecipitációs (ChIP) kísérletekhez; továbbá vizsgáltuk a sejtliofilezés alkalmasságát mint potenciálisan költséghatékony RNS-archiválási módszer; valamint elsőként vizsgáltuk a széles körben alkalmazott humán B-limfoblasztoid sejtvonal (LCL) modell DNS-szekvenciától független funkcionális genomikai variabilitásának kvalitatív és kvantitatív sajátságait. Mivel a ChIP módszer nem rendelkezik széles körben elfogadott folyamatkontrollokkal, munkánk során in vitro evolúciós módszerrel kifejlesztettünk olyan, felszínükön különböző peptideket bemutató bakteriofágokat, amelyek erősen kötődnek különböző ChIP-minőségű, transzkripciós faktor-ellenes antitestekhez. Ezen reagensek egyszerűen sokszorozhatóak, és heterológ külső kontrollként használhatóak a kísérletes mintaveszteség normalizálására. A ChIP mellett az RNS szekvenálás is széles körben elterjedt funkcionális genomikai módszer, amely alkalmas biológialag releváns sejtállapotok transzkriptomikai jellemzésére. Az RNS-alapú vizsgálatokra szánt szövetek fagyasztott állapotban történő tárolása jelentős működtetési költségekkel és környezeti terheléssel jár. Munkánk során megvizsgáltuk a potenciálisan költséghatékony sejtliofilezés és az azt követő szobahőmérsékleten történő mintatárolás hatását az izolált celluláris RNS minőségére. Míg az epigallokatekin-gallát nem bizonyult alkalmas lioprotektánsnak RNS-alapú vizsgálatokhoz, a D-trehalóz megfelelő védelmet nyújtott liofilezés és többhetes szobahőmérsékleten történő tárolás során, magas kitermelést és kiváló RNS-minőséget eredményezve mind alacsony-, mind magas áteresztőképességű vizsgálatokhoz. A humán LCL sejtvonal modellrendszert széles körben alkalmazzák a génexpressziós szabályozás általános szabályszerűségeinek és genetikai hátterének vizsgálatára. Ennek tükrében nagy jelentőséggel bírhat az egyes LCL sejtvonalak közötti genotípus-független funkcionális genomikai variabilitás jellegének és mértékének ismerete. Öt, azonos személyből származó LCL sejtonal vizsgálata során kimutattuk, hogy az aktív (H3K27ac-jelölt) génszabályozó elemek közel negyede mutat variábilis acetilációt, amely enyhébb transzkriptóm-variabilitással párosult. Továbbá a génexpressziós eltérések kemoterápiás szerekkel szembeni eltérő sejtválaszt okozhatnak, így javasolt az RNS-szintek beépítése az LCL-alapú QTL-vizsgálati tervekbe. Összegezve, eredményeink kiindulási pontként szolgálhatnak a költséghatékonyabb és racionálisabb kísérlettervezéshez a funkcionális genomika keretein belül.hu_HU
dc.description.abstractThe past decade has witnessed the rapid development and maturation of functional genomics methods, which provide genome-wide view on various aspects of gene regulation, as well as the emergence of novel approaches to sharing scientific resources. We aimed at contributing to the field of functional genomics in three ways: first, by developing a novel, bacteriophage-based spike-in procedural control system for chromatin immunoprecipitation (ChIP); second, by evaluating the utility of cell lyophilization as a potentially cost-effective means to preserve RNA as an analyte; and third, by uncovering, for the first time, the extent and nature of non-DNA-driven functional genomic variability of the widely used human B-lymphoblastoid cell line model. In our efforts to address the long-standing need for ChIP procedural controls, we developed peptide-displaying bacteriophages which strongly bind various ChIP-grade anti-transcription factor antibodies using in vitro evolution. These reagents are renewable, and may be used as heterologous external controls (normalizers) to account for experimental sample loss. RNA sequencing, another widespread functional genomics method, is used to uncover transcriptomic signatures of biologically relevant cellular states. The frozen storage of tissues intended for RNA-based experimental use is associated with high operational costs and environmental burden. We assessed the utility of lyophilization as a potentially cost-effective cell preservation and storage method for cellular samples. While epigallocatechin-gallate was found not to be suitable as a cellular lyoprotectant for RNA-based studies, D-trehalose provided sufficient RNA protection during lyophilization and weeks of room temperature storage, resulting in high yields and excellent RNA quality for both low-throughput methods and RNA sequencing. As the human B-lymphoblastoid cell line model system is widely used for uncovering general rules and genomic context of gene regulation. we investigated the extent and nature of LCL-to-LCL functional genomic variability in the same genotype context. Using five LCLs from the same individual we showed that almost one-fourth of active (H3K27ac-marked) gene regulatory elements were variably acetylated, coupled to a modest transcriptomic variability. Additionally, isogenic gene expression variability may affect chemotherapeutic drug response, as shown in the example of the DPYD gene and 5-fluorouracil. Therefore it is suggested to consider baseline RNA levels during LCL-based quantitative trait locus mapping study design. In summary, our results provide a baseline for more cost-effective and rational experimental design in the framework of functional genomics.hu_HU
dc.format.extent121hu_HU
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/2437/276888
dc.language.isohuhu_HU
dc.language.isoenhu_HU
dc.subjectphage displayhu_HU
dc.subjectRNA-Seqhu_HU
dc.subjectB-lymphoblastoid cell linehu_HU
dc.subject.disciplineElméleti orvostudományokhu
dc.subject.sciencefieldOrvostudományokhu
dc.titleDevelopment and characterization of experimental tools for functional genomics researchhu_HU
dc.title.translatedFunkcionális genomikai vizsgálatok során alkalmazható kísérletes eszközök fejlesztése és jellemzésehu_HU
Fájlok
Eredeti köteg (ORIGINAL bundle)
Megjelenítve 1 - 4 (Összesen 4)
Nincs kép
Név:
Ozgyin_Lilla_ertekezes.pdf
Méret:
4.67 MB
Formátum:
Adobe Portable Document Format
Leírás:
értekezés (angol)
Letöltés
Nincs kép
Név:
Ozgyin_Lilla_meghivo.pdf
Méret:
254.16 KB
Formátum:
Adobe Portable Document Format
Leírás:
meghívó
Letöltés
Nincs kép
Név:
Ozgyin_Lilla_tezis_magyar.pdf
Méret:
1.21 MB
Formátum:
Adobe Portable Document Format
Leírás:
tézisek (magyar)
Letöltés
Nincs kép
Név:
Ozgyin_Lilla_tezis_angol.pdf
Méret:
1.09 MB
Formátum:
Adobe Portable Document Format
Leírás:
tézisek (angol)
Letöltés
Engedélyek köteg
Megjelenítve 1 - 1 (Összesen 1)
Nincs kép
Név:
license.txt
Méret:
1.93 KB
Formátum:
Item-specific license agreed upon to submission
Leírás:
Letöltés
Gyűjtemények
Molekuláris Sejt- és Immunbiológia Doktori Iskola