Új típusú protein foszfatázok vizsgálata Drosophila melanogaster-ben

Absztrakt

A PPY és PPN Drosophila specifikus, új típusú protein foszfatázok. Leírták az őket kódoló géneket és vannak adatok a génről átíródó fehérjékre vonatkozóan is, de biológiai szerepük eddig még ismeretlen. Nem ismerjük ezen új típusú protein foszfatázok kölcsönható fehérjéit sem, amelyek funkciójából következtetni lehetne az enzimek szerepére. Előkísérleteink során élesztő két-hibrid módszerrel azonosítottunk öt, a PPY-nal, és egy, a PPN-nel kölcsönható fehérjét. További vizsgálatainkban az egyik PPY-nal kölcsönható fehérjét, a PPYR1-et vizsgáltuk meg részletesebben. A PPY és a PPYR1 specifikus kapcsolódását több független módszerrel: immunprecipitációval, “pull-down” kísérlettel és felületi plazmon rezonanciával is alátámasztottuk. SDS-PAGE során mutatott anomáliás mozgékonysága, CD-spektruma, proteázok iránti érzékenysége és hőstabilitása arra utal, hogy a rekombináns PPYR1 az eredendően rendezetlen szerkezetű fehérjék közé tartozik. A PPYR1 aminosav sorrendje alapján 40% homológiát mutat a PAI-1 mRNS-kötő fehérjékkel. Kísérleteink igazolták a PPYR1 in vitro RNS-kötő képességét. A PPYR1 tartalmaz egy protein kináz A felismerő helyet az RNS-kötő régióban. Igazoltuk, hogy a protein kináz A in vitro körülmények között képes foszforilálni a rekombináns PPYR1-et. Azt találtuk, hogy sem a foszforilált, sem a nem foszforilált forma nem tekinthető a PPY foszfatáz hatékony gátlószerének. Biokémiai vizsgálataink alapján a PPYR1 feladata valószínűleg az lehet, hogy a PPY-t összekapcsolja más fehérjékkel, illetve RNS-sel. A PPYR1 mRNS-t a kifejlett ecetmuslica tesztiszében és ováriumában mutattuk ki. A PPYR1 fehérjét ezen kívül korai embriókban is megtaláltuk. Immunhisztokémiai módszerrel igazoltuk, hogy a PPYR1 az ováriumban a dajkasejtekből jut be a petesejtbe. Valószínűleg ez az anyai eredetű fehérje kerül az embriókba. Feltételezzük, hogy a PPYR1 RNS-hez kapcsolódva fejti ki hatását az embrionális fejlődés korai szakaszában. A Drosophila tesztiszében az anyai géntermékhez képest egy nagyobb méretű zigótikus fehérjét detektáltunk. A PPYR1 fehérjét a PPY-nal együtt megtaláltuk a tesztisz apikális részén elhelyezkedő csírasejtekben és az elsődleges spermatocitákban is. A két fehérje együttes előfordulása az azonos típusú sejtekben lehetőséget biztosít az in vivo kölcsönhatás kialakulására. Kísérleteink szerint tehát a PPYR1 anyai eredetű és zigotikus formái egymástól különböző szerepet játszhatnak a Drosophila sperma, illetve embrió fejlődésében.

PPY and PPN are two novel Drosophila specific protein phosphatases. Although the genes and gene products of the two phosphatases have been described their physiological role remained an open question. The lack of information on the interacting partners of the phosphatases, would suggest a physiological role for these enzymes. In our preliminary experiments we identified five proteins that interact with PPY and one interacting protein of PPN. In our subsequent work we selected one of the PPY interacting proteins, termed PPYR1, for more detailed investigation. The specific interaction between PPY and PPYR1 has been confirmed by several independent methods including immunoprecipitation, “pull-down” experiment, and surface plasmon resonance spectroscopy. Based on its abnormal mobility in SDS-PAGE, CD-spectrum, sensitivity to proteases, and heat stability we concluded that PPYR1 was an intrinsically unstructured protein. The primary structure of PPYR1 has 40 % homology with that of PAI-1, an mRNA-binding protein. We demonstrated the RNA-binding capacity of PPYR1 by in vitro experiments. We found a protein kinase A recognition site in the RNA-binding region. We confirmed that protein kinase A indeed phosphorylates recombinant PPYR1 under in vitro conditions. We found that neither the phosphorylated nore the dephosphorylated form of PPYR1 acted as an efficient inhibitor of the PPY phosphatase. According to its biochemical chemical properties PPYR1 can function as a scaffold for the organization of protein and RNA complexes with PPY. The mRNA of PPYR1 was detected in the testis and ovarium of the adult fruit flies. In addition, PPYR1 protein was found in the early Drosophila embryos. The transport of PPYR1 from the nurse cells to the oocyte in the egg chamber was proven by immunohystochemical methods. It is likely that the protein of maternal origin accumulates in the embryos. We suggest that RNA-bound PPYR1 is important in the early development of the embryo. In the testis of Drosophila we observed a zygotic form of PPYR1 that has a larger molecular mass than the maternal gene product. PPYR1 and PPY proteins were localized in the small germ cells and in the early spermatocytes at the apical tip of the testis. The colocalisation of the two proteins in the same cell types makes their in vivo interaction possible. According to our experimental results PPYR1 has two different forms; the maternal and zygotic proteins which play different roles in the development of sperm cells or the embryos.

Leírás
Kulcsszavak
Drosophilia melanogaster
Forrás