A kalcium-függő klorid áram szerepe szívizomsejteken

Dátum
Szerzők
Váczi, Krisztina
Folyóirat címe
Folyóirat ISSN
Kötet címe (évfolyam száma)
Kiadó
Absztrakt
Az ionáramoknak az akciós potenciál (AP) kialakításában betöltött szerepének megértése nagy jelentőséggel bírhat, hiszen ezen csatornák kóros működése arrhythmiák kialakulásához vezethet, melynek hirtelen szívhalál lehet a következménye. Annak ellenére, hogy a Ca2+-függő Cl− áramról (ICl(Ca)) ismert, hogy kóros működése arrhythmiát okozhat, a ICl(Ca) pontos szerepe az AP kialakításában kevésbé ismert. Feltételezik, hogy a TMEM16A és/vagy Bestrophin-3 proteinek lehetnek felelősek a csatorna kialakításáért. Kísérleteink célja az volt, hogy összehasonlítsuk két ismert gátlószer, a 9-antracén karboxilsav (9 AC) és a 4,4’-diisotiocianostilbén-2,2’-diszulfonsav (DIDS) hatásait, és eldöntsük, hogy melyik alkalmasabb a ICl(Ca) detektálására. Továbbá, célunk volt a ICl(Ca) AP alatti (Ca2+ puffer nélkül, AP voltage-clamp technika) és megváltozott intracelluláris Ca2+ koncentráció ([Ca2+]i) melletti aktivációjának tanulmányozása kutya kamrai szívizomsejteken. A TMEM16A és a Bestrophin-3 expressziójának és esetleges Cav1.2 proteinnel való ko-lokalizációjának a vizsgálatát kutya kamrai szívizomsejteken és humán szívizommintákon is elvégeztük. Megállapítottuk, hogy a 9-AC (0,5 mmol/l) és a DIDS (0,2 mmol/l) is növelte az AP időtartamot. A voltage-clamp technikával mért DIDS- és 9 AC-érzékeny áram amplitúdók azonosak voltak. A DIDS, a 9 AC-val ellentétben szignifikánsan csökkentette a depolarizáció maximális sebességének értékét, ami a DIDS Na+ áram gátló hatására utal. AP-clamp mérések során a 9 AC-érzékeny áramgörbe (ICl(Ca)) egy korai outward és egy késői inward komponensből tevődött össze, melyek időben az első fázis és a terminális repolarizációnak megfelelően jelentkeztek. A ryanodin és az EGTA mindkét komponens amplitúdóját csökkentette, míg a BAPTA teljesen megszüntette az áramkomponenseket. Az 1,1 µmol/l [Ca2+]i (a systoles [Ca2+] megfelelő érték) csökkentette a ICl(Ca) amplitúdóját, ezzel szemben a [Ca2+]i növelése Bay K8644, isoproterenol, és a magasabb ingerlési frekvencia által növelte a ICl(Ca)-ot. Ezen eredmények arra utalnak, hogy az L-típusú Ca2+ csatornákon beáramló Ca2+ elengedhetetlen a ICl(Ca) fiziológiás aktivációjához. A TMEM16A és Bestrophin-3 erős ko-lokalizációt mutatott egymással és a Cav1.2 fehérjével kutya izolált szívizomsejteken és humán szívizommintákon egyaránt. Eredményeink arra utalnak, hogy a DIDS és a 9 AC egyformán jól használható voltage-clamp mérésekben, de a 9 AC kedvezőbb AP mérésekben, mert nem gátolja a Na+ csatornákat. A ICl(Ca) aktivációjához az L-típusú Ca2+ csatornákon át beáramló Ca2+ szükséges. A sarcoplasmaticus reticulumból felszabaduló Ca2+ nem nélkülözhetetlen az áram aktivációjához, az áram aktivációjának felerősödéséhez járul hozzá. A ICl(Ca) aktivációjához magas [Ca2+] szükséges a diádikus résben, melyet a BAPTA megfelelően tud pufferelni.
Understanding the role of ionic currents in shaping the cardiac action potential (AP) has great importance as channel malfunctions can lead to sudden cardiac death by inducing arrhythmias. Despite the possible contribution of (ICl(Ca)) may mediated by TMEM16A and/or Bestrophin-3 to cardiac arrhythmias, the true profile of ICl(Ca) during an actual ventricular AP, is poorly understood. In this study we aimed to explore which blocker, 4,4’-diisothiocyanostilbene-2,2’-disulfonic acid (DIDS) or 9-anthracene carboxylic acid (9 AC) is preferable to visualize the profile of ICl(Ca). We aimed to study ICl(Ca) at normal Ca2+ cycling and by AP voltage-clamp as well as in conditions designed to change [Ca2+]i in canine ventricular myocytes. The expression of TMEM16A and/or Bestrophin-3 in canine left ventricular myocytes and human ventricular myocardium by immunolabelling was examined. The possible spatial distribution of these proteins and their co-localization with Cav1.2 was also studied. Both inhibitors, DIDS (0.2 mmol/l) and 9 AC (0.5 mmol/l) increased AP duration. DIDS- and 9 AC-sensitive currents were identical in voltage-clamp conditions. 9 AC did not influence either the AP amplitude or the maximal rate of depolarizations (Vmax), while DIDS caused marked reduction of Vmax. The profile of ICl(Ca), identified as a 9 AC-sensitive current under AP voltage-clamp conditions, contained an early fast outward and a late inward component, overlapping early and terminal repolarizations, respectively. Both components were moderately reduced by ryanodine, while fully abolished by BAPTA, but not EGTA. Setting [Ca2+]i to the systolic level measured in the bulk cytoplasm (1.1 µmol/l) decreased ICl(Ca). Increase in [Ca2+]i elicited by application of BayK 8644, isoproterenol, and faster stimulation rates increased the amplitude of ICl(Ca). We concluded that Ca2+-entry through L-type Ca2+ channels is essential for activation of ICl(Ca). TMEM16A and Bestrophin-3 showed strong co-localization with one another and also with Cav1.2 channels, when assessed using immunolabelling and confocal microscopy in both canine myocytes and human ventricular myocardium. These results suggest that DIDS and 9 AC are equally useful to study ICl(Ca) during voltage-clamp but 9 AC is superior in AP due to its lack of sodium channel inhibition. Activation of ICl(Ca) in canine ventricular cells requires Ca2+-entry through neighboring L-type Ca2+ channels and is only augmented by SR Ca2+-release. Substantial activation of ICl(Ca) requires high Ca2+ in the dyadic clefts which can be effectively buffered by BAPTA, but not EGTA.
Leírás
Kulcsszavak
kalcium-függő klorid áram, TMEM16A, Bestrophin-3, emlős szívizomsejtek, akciós potenciál, ionáramok, calcium-activated chloride current, mammalian cardiomyocytes, action potential, ion currents
Forrás