Towards Next Generation Glycoanalytics: Automatable Biomarker Discovery

Dátum
Szerzők
Váradi, Csaba
Folyóirat címe
Folyóirat ISSN
Kötet címe (évfolyam száma)
Kiadó
Absztrakt
A glikoziláció biomarker potenciálja került bemutatásra ebben a tézisben, a haptoglobin és IgG glikoproteinekre fókuszálva. A haptoglobin glikozilációjának változásai már számos korábbi publikációban leírásra kerültek, mi viszont a glikánok elágazási és fukozilációs fokának változásaira fordítottunk kiemelt figyelmet. A talált eredmények megegyeznek a korábbi tanulmányokban leírtakkal minthogy emelkedett fukozilációs és elágazási fokot sikerült kimutatni a haptoglobin glikánjain a gyulladásos és daganatos tüdőbetegségekben. A válaszadók azonosítása rendkivül fontos olyan hosszan tartó költséges kezelések esetén mint a biológiai terápiák. RA-ben és CD-ben a jelenlegi pontozós rendszerek segítségével hónapokba telik a válaszadók azonositása. Az IgG glikoziláció köztudottan változik ezekben a betegségekben, mely magában hordozza a lehetőséget, hogy markerként hasznosítsuk. A CD páciensekben 2 héttel az anti-TNFα kezelés után sikerült kimutatni szignifikáns változást mely alapján megkülönböztethetők a válaszadók és nem-válaszadók. Ez az eredmény magában hordozza annak lehetőségét, hogy a jövőben az IgG glikozilációt esetleges biomarkerként használják ebben a betegségben. A jelenlegi glikánpreparálási technológiákat több napos inkubálás, manuális pipettázás és a vákum-centrifuga nélkülözhetetlensége jellemzi. Erre jelenthet megoldást az általunk újonnan kifejlesztett mágneses gyöngy alapú mintapreparálási eljárás mely mindössze 4 óra alatt képes akár 96 mintát elkészíteni vákumcentrifuga szükségessége nélkül és teljes mértékben automatizálható. Ez nagy mértékben megkönnyítheti a kutatók dolgát a jövőben, mindamellett megnövelheti a kísérletek precizitását és reprodukálhatóságát.
The biomarker potential of glycosylation is presented in this work focusing on haptoglobin and IgG. Haptoglobin glycosylation was reportedly altered in inflammatory and malignant conditions. Fucosylation- and branching-degrees were examined and the importance of linkage-specific fucosylation-degrees was pointed out. The preliminary results were in agreement with the literature as increased branching and fucosylation was found in various pathological conditions. Prediction of patient response for any therapy is critical in inflammatory diseases such as CD and RA, as currently used scoring systems require months for responder identification. The importance of reliable biomarkers in these diseases is essential as the efficacy of biological therapies can vary between patients. Utilizing the high resolving power of CE-LIF, 26 IgG glycoforms were examined in RA and CD before and after anti-TNFα treatment. In RA, three low abundant galactosylated structures were found to be significantly different before the treatment and all responders showed higher galactosylation levels. No significant alteration was detected in RA in response to the treatment. In CD FA2G2S1 level was significantly increased in response to anti-TNFα therapy, thus being a possible candidate marker for responder identification. This finding was also supported by transcriptomics analysis of the corresponding glycosyl-transferase and glycosidase enzymes, as higher sialyl-transferase and lower sialidase activity was found. For reliable biomarkers huge number of samples has to be analyzed which necessitates automated high-throughput methods. A magnetic bead based protocol was developed for N-glycosylation analysis of glycoproteins not requiring hard-to-automate centrifugation and vacuum-centrifugation steps. Glycan release, APTS-labeling and clean-up were optimized resulting in a 4 hours magnetic bead based process with excellent yield and high reproducibility. The next step of this work is to apply this optimized magnetic bead based protocol with all steps from PNGase F digestion, through optimized fluorophore labeling and clean-up to high throughput sample processing in 96 well plates format with simple liquid handling robots allowing full automation.
Leírás
Kulcsszavak
glikoziláció, kapilláris elektroforézis, biomarker kutatás, glycosylation, biomarkers, capillary electrophoresis
Forrás