Munkánk során három már ismert AT mutáció (ATBp3, AT Basel, AT Padua) karakterizálását és kilenc új AT mutáció (p.Arg14Lys, p.Cys32Tyr, p.Arg78Gly, p.Met121Arg, p.Leu245Pro, p.Leu270Argfs14, p.Asn450Ile, p.Gly456delins_Ala_Thr, p.Pro461Thr) részletes biokémiai és in silico elemzését, patogenitásuk igazolását végeztük el. Az eredményeink alapján a IIHBS típusú mutációk módosult AT-heparin kölcsönhatásának hátterében különböző molekuláris mechanizmusok állhatnak. A p-anti-FXa és a hc-anti-FXa AT aktivitás aránya az AT Bp3 homozigótáknál a legmagasabb, ami azt bizonyítja, hogy e betegcsoportban legkórosabb az AT-heparin kölcsönhatásra. Ha azonban csak a heterozigóta betegek p-anti-FXa és a hc-anti-FXa AT aktivitás arányát vetjük össze, az AT Padua mutációt hordozók értéke a legmagasabb. Kísérleteink eredménye ezzel összhangban áll, az AT Padua mutációnak van a legerősebb hatása az antithrombinon. Ez esetben figyeltük meg a leglassabb AT-heparin komplex kialakulást és a leggyengébb kölcsönhatást a heparinnal. A keresztezett immunoelektroforézis vizsgálatban az AT Padua mutatott a normál frakcióhoz képest nagyobb alacsony-affinitású frakciót. A molekula modellező tanulmányok megerősítik ezeket az eredményeket, mivel az AT Padua konformációs változásokat mutatott az AT N-terminális 30 – 35 régiójában és nagyon megnövekedett fluktuációkat az RMSF analízisben, sugallván, hogy a mutáció érinti mind a konformációt és az allosztériát távoli részein az AT Padua molekulának. Az AT Basel sokkal lassabban köt a heparinhoz, mint más mutánsok feltehetően a 22 – 46 hurokban bekövetkezett konformációs változás miatt. Amint az AT-heparin komplex kialakult, az allosztérikus aktivitása e mutánsnak, valamint az AT Basel – heparin komplex stabilitása valószínűleg csak kis mértékben érintett. Az ATBp3 mutatta a leggyorsabb és legerősebb AT-heparin komplex kialakulást az SPR vizsgálatokban. Azonban az allosztérikus aktiválása az ATBp3-nak érintett, azonfelül a molekula több régiójának a megnövekedett fluktuációja felveti ennek a variánsnak a destabilizáló hatását. Ezek együttvéve a humán plazmából izolált homozigóta ATBp3 csökkent termostabilitásával, felvetik ennek a mutációnak a pathogenitásában egy mennyiségi komponens jelenlétét is. A kilenc új mutáns (p.Arg14Lys, p.Cys32Tyr, p.Arg78Gly, p.Met121Arg, p.Leu245Pro, p.Leu270Argfs14, p.Asn450Ile, p.Gly456delins_Ala_Thr, p.Pro461Thr) esetében in vitro expressziós kísérletekkel és in silico analízissel bizonyítottunk különböző mechanizmusokat a pathogenitás hátterében. Három mutáns esetében (p.Cys32Tyr, p.Leu270Argfs*14, p.Asn450Ile) a protein szintézis zavara, másik három esetben (p.Met121Arg, p.Leu245Pro,p.Gly456delins_Ala_Thr) szekréciós zavar okoz I-es típusú ATD-t. A p.Arg78Gly mutáció IIHBS, míg a p.Pro461Thr IIPE típusba sorolható, a szignálpeptidet érintő p.Arg14Lys mutáció patogén szerepe nem igazolódott.

In this study we examined three, already known, IIHBS type AT mutations (ATBp3, AT Basel, AT Padua) and investigated nine novel AT mutations (p.Arg14Lys, p.Cys32Tyr, p.Arg78Gly, p.Met121Arg, p.Leu245Pro, p.Leu270Argfs14, p.Asn450Ile, p.Gly456delins_Ala_Thr, p.Pro461Thr) that have not been reported before. According to our results there may be different molecular mechanisms in the background of altered AT-heparin interaction in case of type IIHBS AT mutations. AT Padua mutation has the strongest effect on AT. We observed the slowest AT-heparin complex formation and the weakest interaction with heparin. AT Padua also exerted a larger low-affinity fraction than normal fraction in CIE experiments. Molecular modeling studies well explain these findings, as AT Padua showed conformational changes in the N-terminal 30-35 region of AT and highly increased fluctuations in RMSF analysis suggesting that the mutation affects both the conformation and the allostery of distant parts of AT Padua molecule. AT Basel binds to heparin more slowly, than other mutants maybe because of the conformational change in the 22-46 loop. Once AT-heparin complex is formed the allosteric activation of AT Basel and the stability of AT Basel-heparin complex might be only slightly affected. ATBp3 showed the fastest and strongest AT-heparin complex formation in SPR studies, however the allosteric activation of ATBp3 is affected, moreover the increased fluctuation in multiple regions of the molecule suggested that this variant has a destabilizing effect. These findings together with the decreased thermostability of homozygous ATBp3 isolated from human plasma suggest the presence of a quantitative component in the pathogenicity of this mutation. Type I ATD caused by altered protein synthesis (p.Cys32Tyr, p.Leu270ArgfsX14, p.Asn450Ile) or secretion disorder (p.Met121Arg, p.Leu245Pro, p.Gly456delins_Ala_Thr) was proved in six mutants, while type II heparin binding site ATD (p.Arg78Gly) and pleiotropic effect ATD (p.Pro461Thr) were suggested in two mutants. Finally, the pathogenic role of p.Arg14Lys was equivocal. We provided evidence to understand the pathogenic nature of novel SERPINC1 mutations by in vitro expression studies.