A TIMAP fehérje szerepe a protein foszfatáz 1 és az endotél barrier funkció szabályozásában

Czikora, István

A TIMAP fehérje szerepe a protein foszfatáz 1 és az endotél barrier funkció szabályozásában

dc.contributor.advisor	Csortos, Csilla
dc.contributor.author	Czikora, István
dc.contributor.authorvariant	Czikora, István
dc.contributor.department	Molekuláris orvostudomány doktori iskola	hu
dc.contributor.submitterdep	DE--OEC--Általános Orvostudományi Kar --
dc.date.accessioned	2011-06-21T07:42:15Z
dc.date.available	2011-06-21T07:42:15Z
dc.date.created	2011	hu_HU
dc.date.defended	2011-07-06
dc.description.abstract	A fehérjék foszfo-Ser/Thr oldalláncainak defoszforilációjával a protein foszfatáz 1 (PP1) számos sejtfolyamat szabályozásában vesz részt. Kísérleteink során a 64 kDa méretű TIMAP fehérjét vizsgáltuk, amely a a MYPT család tagja és ezért a PP1c katalitikus alegység egyik lehetséges regulátor alegysége. Célunk volt a TIMAP és PP1c közötti kölcsönhatás, valamint a TIMAP Ser333 és Ser337 oldalláncai foszforilációja hatásának vizsgálata. A TIMAP expressziós szintje az endotél sejtekben más sejttípusokhoz viszonyítva magas és a fehérje a plazmamembránhoz asszociálódik. Ezért kísérleteinkkel a TIMAP humán illetve marha tüdő artéria endotél sejtek barrier funkciójának szabályozásában betöltött szerepét is igyekeztünk feltárni. Különböző módszerek alkalmazásával igazoltuk a TIMAP és a PP1 katalitikus alegysége közötti fehérje-fehérje kölcsönhatást. Eredményeink szerint a PP1c β izoformája kötődik specifikusan a TIMAP-hoz (Ka=1.8x106 M-1). A TIMAP tiofoszforilációja PKA-val illetve PKA- és GSK3enzimekkel alig, vagy csak kis mértékben módosította a TIMAP és PP1c közötti kölcsönhatásra jellemző asszociációs konstans értékekét. Viszont a nem és egyszeresen tiofoszforilált TIMAP gátolja a PP1cβ aktivitását, a kétszeresen tiofoszforilált formának pedig nincs hatása a foszfatáz akivitásra az általunk vizsgált szubsztrátokkal. A TIMAP endotél barrier funkcióban betöltött szerepének vizsgálata során siRNS módszert használtunk. Mértük a sejtek elektromos rezisztenciáját különböző effektorok jelenlétében, és kimutattuk, hogy a TIMAP csendesített sejtekben a kontrollhoz képest a barrier funkciót erősítő szfingozin-1 foszfát és ATP hatása mérséklődött, míg a barrier diszfunkciót kiváltó ágenseké, trombin és nokodazol, erősödött. Továbbá azt találtuk, hogy forskolin előkezelés (PKA aktiválás) kivédte a thrombin által kiváltott ERM foszforilációt és barrier diszfunkciót a kontroll sejtekben, viszont a TIMAP specifikus siRNS-sel kezelt sejtekben a forskolin ugyanezen hatását nem tapasztaltuk. GSK3 inhibitor alkalmazásával igazoltuk, hogy endotél sejtekben a PKA aktiválást GSK3 aktiválódás követi, és mindkét kináz aktiválása szükséges a forskolin endotél barrier funkciót védő hatásának kifejtéséhez. Mindezekből arra következtetünk, hogy a TIMAP részt vesz az ERM fehérjék foszforiláltsági szintjének szabályozásában és ez a funkciója PKA aktivitás által kontrollált, valamint a TIMAP a barrier funkciót pozitívan szabályozza. Protein phosphatase 1 (PP1) regulates numerous cellular processes by dephosphorylating phospho-Ser/Thr residues of proteins. TIMAP protein (64 kDa), as a member of the MYPT family, is a putative regulatory subunit of the catalytic subunit of PP1 (PP1c). Our aim was to study the interaction between TIMAP and PP1c; and to study the effect of the phosphorylation of Ser333 and Ser337 side chains in TIMAP on this interaction. TIMAP is highly expressed in endothelial cells (EC) compared to other cell lines, and it localizes to the plasma membrane. Therefore we studied the role of TIMAP in the regulation of barrier function of human and bovine pulmonary artery endothelial cells. Using several methods we provided evidence for specific interaction between TIMAP and PP1c; TIMAP binds preferentially the beta isoform of PP1c (Ka=1.8x106 M-1). Thiophosphorylation of TIMAP by PKA or sequential thiophosphorylation by PKA and GSK3 only slightly modifies the association constant for the interaction of TIMAP with PP1c. However, non- and mono-thiophosphorylated forms of TIMAP inhibit PP1cβ activity, while the double-thiophosphorylated form does not affect the phosphatase activity with the utilized substrates. To investigate the role of TIMAP in EC barrier regulation, we depleted TIMAP in HPAEC. We found that depletion of TIMAP attenuates the increases in transendothelial electrical resistance induced by the barrier protective agents (S1P and ATP) and enhances the effect of barrier-compromising agents (thrombin, nocodazole) demonstrating a barrier-protective role of TIMAP in EC. PKA activation by forskolin treatment of EC prevents thrombin evoked barrier dysfunction and ERM phosphorylation at the cell membrane. On the contrary in TIMAP depleted cells forskolin failed to affect the thrombin effect, and the ERM proteins remained phosphorylated. These data demonstrate that TIMAP is involved in the EC barrier protection as part of PKA-mediated ERM (ezrin-radixin-moesin) dephosphorylation. Using a specific GSK3inhibitor we have shown that PKA activation is followed by GSK3activation in bovine pulmonary EC and activation of both kinases is required for the rescuing effect of forskolin and protects the EC barrier function.	hu_HU
dc.format.extent	100	hu_HU
dc.identifier.uri	http://hdl.handle.net/2437/109312
dc.language.iso	hu	hu_HU
dc.language.iso	en	hu_HU
dc.subject	Barrier funkció	hu_HU
dc.subject	Barrier function	hu_HU
dc.subject	Protein foszfatáz 1
dc.subject	protein phosphatase 1
dc.subject	TIMAP
dc.subject.discipline	Elméleti orvostudományok	hu
dc.subject.sciencefield	Orvostudományok	hu
dc.title	A TIMAP fehérje szerepe a protein foszfatáz 1 és az endotél barrier funkció szabályozásában	hu_HU
dc.title.translated	The Role of TIMAP in the Regulation of Protein Phosphatase 1 and Endothelial Barrier Function	hu_HU