ABSZTRAKT Bevezetés: Az alfa2-plazmin inhibitor (α2-PI) a fibrinolízis fő enzimének a plazminnak az elsődleges gátlója. Egyláncú 67 kDa glikoproteinként termelődik a májsejtekben, majd a vérben enzimatikusan hasítódik a molekula mindkét végén, ennek eredményeként a plazmában négy féle izoforma kering. A molekula N-terminális vége részt vesz a fibrinhez való kötődésben, míg a C-terminális rész a plazminhoz/plazminogénhez kötődik, meggyorsítva ezzel az inaktiválást. A C-terminális hasítás pontos helye és a hasítást végző enzim még nem ismert. Egy korábbi közlemény alapján az feltételezhető, hogy több enzim is képes lehet a hasításra, de az enzimeket még nem azonosították. Célkitűzés: A C-terminális hasítás miatt az α2-PI elveszíti a plazminogén-kötő régióját, ami funkcionális következményekkel jár, ezért fontos lenne az enzimek azonosítása. Munkánk során a plazmában az α2-PI-vel molekuláris interakcióba lépő fehérjék azonosítását tűztük ki célul. Anyagok és módszerek: A kísérletek során HepG2 sejtek által expresszált α2-PI-t használtunk. A sejteket normál ill. fotoszenzitív aminosavakat tartalmazó tápfolyadékban tenyésztettük, az újonnan termelődött α2-PI mennyiségét ELISA módszerrel, a minőségét Western blottal vizsgáltuk. A módosított aminosavakat tartalmazó α2-PI-t a felülúszóból immun-precipitáltuk, majd humán plazmában inkubáltuk és UV fény hatására a fotoszenzitív aminosavak és a hozzájuk közel kerülő peptidszakaszok között keresztkötéseket hoztunk létre. A kialakult kölcsönhatást Western blot technika segítségével tettük láthatóvá.
Eredmények: A HepG2 sejtfelülúszókban 24 órás kezelést követően az α2-PI mennyisége a kontrollban 413 ng/mL, a kezelt mintában 82 ng/mL volt. Hosszabb kezeléssel (72 óra) a fotoszenzitív α2-PI mennyisége nem volt növelhető (1016 ill. 65 ng/mL). Mindkét alkalommal a várt molekulatömegnek megfelelő, ép fehérjék termelődtek a Western blot alapján. A humán plazmában történő inkubációt követően a fotoszenzitív α2-PI esetén egy az eredetinél magasabb molekulasúlyú sáv volt detektálható Western blot technikával. Ez arra utal, hogy a fotoszenzitív α2-PI valamelyik plazmafehérjével kölcsönhatásba lépett. A kérdéses partner azonosítását tömegspektrometriás módszerrel tervezzük végezni, azonban még nem sikerült elegendő mennyiségben előállítani a keresztkötött terméket. Konklúzió: További módosítások után a módszer ígéretesnek tűnik arra, hogy az α2-PI-vel a plazmában kölcsönhatásba lépő molekulákat azonosítsuk, közöttük esetleg a C-terminálisan hasító enzimet is.