Molekuláris Sejt- és Immunbiológia Doktori Iskola

Állandó link (URI) ehhez a gyűjteményhez

https://hdl.handle.net/2437/31600

Általános Orvostudományi Kar

Molekuláris Sejt- és Immunbiológia Doktori Iskola
(vezető: Dr. Balogh István)

Orvostudományi doktori tanács

D183

tudományág:
- elméleti orvostudományok

Böngészés

Molekuláris Sejt- és Immunbiológia Doktori Iskola Szerző szerinti böngészés "Bagossi, Péter"

Megjelenítve 1 - 2 (Összesen 2)
  • Nincs kép
    TételKorlátozottan hozzáférhető
    Alfa-amilázok termékanalízisen és molekuláris modellezésen alapuló alhelytérképezése és transzglikozidáz aktivitásuk vizsgálata
    Mótyán, János András; Bagossi, Péter; Harangi, János; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola; DE--OEC--Általános Orvostudományi Kar -- Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet; DE--TEK--Természettudományi Kar -- Biokémiai Tanszék
    A doktori értekezésben bemutatott munka során az aktív centrum térképezés módszerét használtuk a másodlagos kötőhelyeken módosított W279A, W278A/Y380A, W279A/Y380A, Y380A, H395A, H395A/Y380A és Y105A/Y380M AMY1 mutánsok vizsgálatára. Elvégeztük az aktív helyen módosított S48Y, V47A, V47F, V47D, V47K/S48G, V47G/S48D, V47L/S48A és V47I/S48I árpa α-amiláz 1 (AMY1) mutánsok alhelytérképezését. A megbízható alhelytérképek elkészítéséhez szükséges bontási képeket 3−11 tagszámú 2-klór-4-nitrofenil-β-D-maltooligoszacharid (CNP-β-D-MOS) szubsztrátsorozat segítségével határoztuk meg. Az alhelytérképek számításához a SUMA (Subsite mapping of α-amylases) számítógépes programot használtuk. Az AMY1 enzimek bontási képeinek meghatározása során a transzglikozilezési aktivitás növekedését tapasztaltuk, elsőként tanulmányoztuk részletesen az AMY1 és mutánsai transzferáz aktivitását. A reakciókörülmények optimalizálását követően elvégeztük a 4-metil-umbelliferil-α-D-maltooligoszacharidok (MU-α-D-MOS) enzimatikus szintézisét a V47F AMY1 mutáns által katalizált transzglikozilezés reakcióban. A 2−5 tagszámú MU-α-D-MOS szubsztrátokat sikeresen alkalmaztuk egy gyors és egyszerű fluorimetriás eljárásban, a Bacillus stearothermophilus maltózképző α-amiláz, a Bacillus licheniformis α-amiláz és a humán nyál α-amiláz kinetikai paramétereinek meghatározásában. A kidolgozott eljárás megoldást jelenthet a fluoreszcens α-amiláz szubsztrátok előállítására, melyek nem érhetők el kereskedelni forgalomban. Egy olyan számítógépes eljárást dogloztunk ki az α-amilázok vizsgálatára, mely az alhelytérképek molekuláris modellezéssel történő számításán alapul. A módszer kidolgozásához a különböző amilázok irodalmi adatai alapján létrehozott tanító halmazt használtuk, az eljárást a kísérletesen meghatározott és a jósolt értékek közötti korreláció alapján optimalizáltuk. Az ellenőrzéshez az AMY1 V47/S48 mutánsainak adataiból létrehozott ellenőrző halmazt használtuk, és a töltött aminosavak mutációval történő bevezetését tartalmazó mutáns enzimek kivételével szintén jó korrelációt kaptunk. A kidolgozott eljárás a vad típusú és mutáns enzimek homológ modelljeit használja az alhelytérképek Sybyl molekulamodellező szoftverrel történő molekulamechanikai számítására és a SUMA programot az elsődleges kísérletes adatok (BCF) jóslására. Módszerünk felhasználható lehet az α-amilázok szerkezet-funkció összefüggéseinek megértésében és a módosított fehérjék előállítására irányuló vizsgálatok támogatásában. In this work we used the method of subsite mapping to examine the W279A, W278A/Y380A, W279A/Y380A, Y380A, H395A, H395A/Y380A and Y105A/Y380M secondary substrate binding site mutants of AMY1. We mapped the active site of S48Y, V47A, V47F, V47D, V47K/S48G, V47G/S48D, V47L/S48A and V47I/S48I active site mutants of barley α-amylase 1 (AMY1). 2-Chloro-4-nitrophenyl-β-D-maltooligo-saccharides (CNP-β-D-MOS) of degree of polymerizaion (DP) 3−11 were used to determine the bond cleavage frequencies (BCF). Subsite binding energies were calculated using the computer program for subsite mapping of α-amylases (SUMA). Enhanced transglycosylation activity of several mutants of AMY1 was observed during the BCF analysis and this ability was further explored and studied systematically. After optimization of reaction conditions, 4-methylumbelliferyl-α-D-maltooligosaccharides (MU-α-D-MOS) of DP2−5 have been successfully synthesized using V47F active site mutant of AMY1. MU-α-D-MOS were used efficiently as fluorogenic substrates in a fast and simple fluorometric α-amylase assay to determine the kinetic parameters of Bacillus stearothermophilus maltogenic α-amylase, Bacillus licheniformis α-amylase and human salivary α-amylase. Described method may be the solution for preparation of fluorogenic α-amylase substrates which are not commercially available up to now. We developed a computer-aided subsite mapping procedure for α-amylases. A training set of data was collected from the literature using published data, to prepare a test set of data we determined experimentally the BCF-s and calculated the subsite maps of V47/S48 single and double mutants of AMY1. Parameters of the calculations were set up to get correlation between the calculated and the experimental binding energies of enzymes of a training set. Calculations on an independent test set also resulted in good correlation, except mutants containing neutral to charged residue substitution. Developed method was adopted for several α-amylases and is useful to calculate subsite binding energies of homologous models of wild-type and mutant enzymes by molecular mechanical program using Sybyl molecular modeling software as well as the primary experimental data (BCFs) with the use of computer program SUMA. Our computer-aided procedure may help to understand structure-function relationship of α-amylases and to design enzymes with new features.
  • Nincs kép
    TételKorlátozottan hozzáférhető
    Humán immundeficiencia vírus 1 proteáz ellenes makromolekuláris inhibitorok tervezése, előállítása és jellemzése
    Miklóssy, Gabriella; Bagossi, Péter; Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola; DE--OEC--Általános Orvostudományi Kar--Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet
    A doktori értekezésemben bemutatott munkáimban célul tűztük ki egy nagy áteresztőképességű és gyors mikrotiter lemez alapú fluorometriás módszer kidolgozását, mely alkalmas különböző retrovirális proteázok aktivitásának és gátlási állandóinak közvetlen összehasonlítására, illetve részben ezen módszerre alapozva, új típusú makromolekuláris HIV-1 PR inhibitorok tervezését, előállítását és tesztelését. Összefoglalásul elmondhatjuk, hogy a munkánk során kidolgozott fluorometriás módszer egy jó alternatíva lehet a hagyományos HPLC-alapú módszer mellett, mivel gyors és egyszerre nagy számú minta kezelését teszi lehetővé. Módszerünket a hagyományos HPLC-alapú módszerrel validáltuk vad típusú HIV-1 és HTLV-1 proteázok, valamint EDANS és DABCYL csoportokat hordozó új tervezésű szubsztrátok felhasználásával. Kidolgoztunk egy új eljárást a fluoreszcens donor és akceptor csoportokat egyszerre hordozó szubsztrátok mérése esetén fellépő belső szűrő hatás korrekciójára. Az új módszer segítségével összehasonlítottuk a HIV-1 és a HTLV-1 proteázok gátlási profilját néhány, már klinikai használatban lévő HIV-1 PR ellenes és néhány, a munkacsoportunk által tervezett HTLV-1 PR inhibitor felhasználásával. Módszerünket későbbiekben sikerrel alkalmaztuk más vad típusú és mutáns retrovirális proteázok esetében is (Kádas és mtsai, 2004; Fehér és mtsai, 2006; Sperka és mtsai, 2007). A továbbiakban a szubsztrátkötő helyen hidrofil, hidrofób és töltött aminosavakat hordozó mutáns HIV-1 proteázokat terveztünk és vizsgáltunk. A mutációk in silico megtervezése után elkészítettük és megtisztítottuk a fehérjéket, majd teszteltük azok in vitro és sejtkultúrás kísérletekben mutatott gátló hatását. A töltött aminosavakat hordozó mutánsaink, amelyek a HIV-1 proteáz ellen tervezett makromolekuláris inhibitorok egy új generációját képviselik, dózisfüggő, specifikus, transz domináns gátló hatást mutattak kísérleteinkben. Elsőként detektáltuk egy vad típusú retrovirális proteáz és egy transz domináns negatív mutáns heterodimerizációját NMR spektroszkópiával. Az Asp25Arg és a Gly49Glu csere egyéb retrovirális proteázokban is gátló hatást eredményezhet a vad típusú proteázzal szemben, mivel ezen aminosavcserék célpontjai a hidrolitikus aktivitáshoz elengedhetetlen katalitikus aszpartátok. ----- We have developed a high throughput microtiter plate fluorescent assay which can be a good alternative to the traditional HPLC-based protease assay, since it is faster and is able to measure several parallel samples. Our assay was validated by using the traditional method and applied to HIV-1 and HTLV-1 proteases. Several new fluorescent substrates containing EDANS/DABCYL groups were designed and tested. We have also developed an alternative method for the inner filter correction. Inhibition profiles of HIV-1 and HTLV-1 PRs were compared using various clinically used HIV-1 PR inhibitors and new HTLV-1 PR inhibitors were also designed and tested. Later, the new method has also been applied successfully for additional retroviral proteases. Furthermore, we have designed and investigated defective HIV-1 proteases which contained mutations in the active site and in the substrate binding site. After the in silico mutagenesis, we prepared and purified selected proteins for in vitro as well as in cell culture experiments to determine their inhibitory effect on wild-type HIV-1 PR. Mutants containing charged residues showed dose-dependent, specific, trans-dominant inhibitory effect in our experiments, and they represent a new generation of macromolecular inhibitors against HIV-1 PR. Heterodimerization could be detected, for the first time, between a wild-type retroviral PR and trans-dominant negative mutants by NMR spectroscopy using our novel hydrophilic constructs and our facile protein folding protocol. The Asp25Arg and the Gly49Glu mutations introduced into analogous positions of other retroviral PRs may exert a similar inhibitory effect on the corresponding wild-type PR. These residues target the catalytic aspartate, thus it may be considered a general strategy for all retroviral PRs.